農(nóng)學(xué)院本科生-農(nóng)桿菌介導(dǎo)gmftsh基因的煙草遺傳轉(zhuǎn)化畢業(yè)論文-文庫吧資料
2025-07-04 13:49本頁面
【正文】 40 48 0實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明稀釋30倍的農(nóng)桿菌所介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的葉片，分化出抗性芽的機(jī)率大。2 結(jié)果與分析 影響根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草的因素 菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響在對(duì)農(nóng)桿菌菌液的稀釋過程中發(fā)現(xiàn)，菌液的濃度對(duì)葉片切口處芽誘導(dǎo)率有很大影響。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，54℃復(fù)性30秒，72℃延伸2分鐘10秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫10分鐘，隨后12℃恒溫。GACCAGCGAGATCCAAACGAA3’ RTPCR檢測(cè)將反轉(zhuǎn)得到的cDNA進(jìn)行RTPCR檢測(cè)。內(nèi)參actin上游引物A1：539。 Buffer 2μlPrimeScript174。 RTPCR Kit II試劑盒中cDNA合成產(chǎn)品TaKaRa Code：DRR037A操作說明。 cDNA的合成cDNA合成依據(jù)TaKaRa試劑公司SYBR174。（11）將吸附柱CR轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入3050ul的RNasefree ddH2O，室溫放置2分鐘，12000rpm離心2分鐘（4℃）。（9）向吸附柱CR中加入700ul的漂洗液RW，室溫靜置2分鐘，12000rpm離心30秒（4℃），倒掉收集管中的廢液。（7），混勻（此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀）。（6）12000rpm離心10分鐘（4℃），樣品會(huì)分成三層：黃色的有機(jī)相，中間層和無色的水相，水相的體積約為所用裂解液RZ試劑的50%。（4）12000rpm離心5分鐘（4℃），取上清，轉(zhuǎn)入一個(gè)新的無RNase的離心管中。（2）80℃保存的大豆各組織材料放入小研缽中，加入液氮快速研磨至粉末，隨后立即加入1000ul的裂解液RZ，在研缽中充分研磨。 轉(zhuǎn)基因煙草RNA的提?。?）采用天跟時(shí)代（TIANGEN）公司的Total RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA用的槍頭、%的DEPC溶液12個(gè)小時(shí)以上，隨后取出高壓滅菌。對(duì)于PCR鑒定陽性的轉(zhuǎn)基因煙草植株，下一步進(jìn)行提取總RNA，進(jìn)行cDNA的合成。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，54℃復(fù)性30秒，72℃延伸2分鐘10秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫10分鐘，隨后12℃恒溫。 PCR鑒定用CTAB法提取得到的煙草基因組DNA為模板［1012］，用GmftsH基因特異性引物：sence:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAGGTTCTCTTCTTTATACGGA(下劃線標(biāo)示為attB1位點(diǎn))；antisence: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTGTGGAGAGCTACACTACATTG(下劃線標(biāo)示為attB2位點(diǎn))；進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以野生型和ddH2O為陰性對(duì)照，含有目的基因的質(zhì)粒為陽性對(duì)照。（12）上清液中加入1/10 體積4M NaCl 溶液后，加入2 倍體積無水乙醇，室溫放置20min 后，10，000rpm 離心5min，沉淀DNA。（9）加入5μl RNase(10mg/ml), 37℃保溫30min。（6）離心去上清液(8，000rpm, 10min，室溫)。（4）室溫下4，000rpm 離心10min，去沉淀，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。（3）于65℃，并且加上40μl 巰基乙醇，中間溫和的混合幾次。 轉(zhuǎn)基因煙草的分子鑒定 轉(zhuǎn)基因煙草DNA的提取采用CTAB微量分離法提取煙草DNA（1）在50ml 離心管中加入20ml 2CTAB 提取緩沖液，65oC 預(yù)熱。(5) 待再生幼苗根系發(fā)達(dá)后，開蓋培養(yǎng)23天強(qiáng)化整株后，取出植株用無菌水清洗掉幼苗根部的瓊脂再移栽到滅菌土的盆缽中放置于室溫中培養(yǎng)。(3) 選擇培養(yǎng) 待愈傷組織分化成苗后用解剖刀切去整株的小植株轉(zhuǎn)入裝有分化培養(yǎng)基MS2的培養(yǎng)罐中，繼續(xù)培養(yǎng)。 農(nóng)桿菌侵染外植體及培養(yǎng)(1) 侵染 將外植體放入上述（5）的菌懸液中，震蕩45分鐘，使農(nóng)桿菌與外植體傷口部位充分接觸，將外植體從農(nóng)桿菌懸浮液中取出，置于滅菌濾紙上吸干，然后置于MS1固體培養(yǎng)基上（葉片光滑面朝上），用封口膜封好后，在25℃的組培室共培養(yǎng)2天。(3) 無菌狀態(tài)下，將培養(yǎng)好的菌液經(jīng)過4000rpm(4℃)離心10分鐘，棄去上清。 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)(1) 挑取含有目的基因的單克隆，接種于YEB培養(yǎng)基上活化，單菌落接種于2ml的YEB液體培養(yǎng)基中（內(nèi)含Kan 50mg/L，Rif 25mg/L，Hyg 50mg/L），28℃，200rpm振蕩過夜。取完全展開葉片，將葉片先用滅菌蒸餾水清洗23次，再用70%的乙醇浸泡45秒，30%%升汞消毒5分鐘，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)后用無菌水清洗45次，最后用滅過菌的濾紙吸干多余水分；。0)（4）氯仿:異戊醇：按體積比24:1混合平衡氯仿和異戊醇，放于棕色試劑瓶中，4℃保存。121℃高壓滅菌鍋滅菌MS3（生根）：1/2MS+Hgy 50ug/ml+IAA 。121℃高壓滅菌鍋滅菌 煙草組織培養(yǎng)基MS1（共培養(yǎng)）：。植物過表達(dá)載體為pMDC83，具有潮霉素抗性，可以進(jìn)行初步篩選。1 材料與方法 材料 植物材料煙草三生煙種子，將野生型煙草種子種植在營養(yǎng)土中，25℃條件下培養(yǎng)4060天左右。而FtsH基因廣泛分布于原核生物和真核生物中，其生物學(xué)功能也多種多樣。近年來，這種純生物的方法由于具有轉(zhuǎn)化率高，可導(dǎo)入大片段DNA，且導(dǎo)入基因的拷貝數(shù)低
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