農桿菌介導轉化法的概述(編輯修改稿)
2024-07-24 08:27 本頁面
【文章內容簡介】 上剪切下來，稱T鏈。切開TDNA后，VirD2蛋白與T一鏈的5’端共價結合，避免核酸外切酶降解T一鏈．新的TDNA底鏈以此鏈為模板，從右端產生的DNA缺口處以5’3’方向進行合成。被取代的舊鏈游離出來，與許多VirE2蛋白分子結合組成TDNA復合體。此外，VirD2作為一個導向蛋白，可以指導整個TDNA復合體從農桿菌進入到植物細胞核。TDNA整合進入植物基因組并表達產生生物學效應．TDNA整合進宿主細胞基因組，是轉化過程中最重要也最關鍵的步驟。TDNA在寄主細胞染色體上的整合是隨機的，但對轉錄活化區(qū)域有所偏好。TDNA通過與事先斷裂的寄主DNA雙鏈(DSB)發(fā)生重組來完成整合，進而進行表達。3轉化方法 目前農桿菌介導轉化單子葉植物最常用的方法是共培養(yǎng)法。利用農桿菌與植物離體組織共培養(yǎng)進行轉化，一般需要經過嚴格的組織培養(yǎng)過程以再生植株，因而轉化周期比較長。共培養(yǎng)前農桿菌感染愈傷組織的方式有：①將整塊愈傷組織浸泡于菌液中靜置培養(yǎng)。②將整塊愈傷組織浸泡于菌液中搖動培養(yǎng)。③將菌液加至愈傷組織上。通常使用的是第一種方式?，F(xiàn)將農桿菌介導的植物遺傳轉化常采用的方法[9]，簡要介紹如下：葉盤法 選取健康的無菌苗，用打孔器打出葉圓盤，將帶有新鮮傷口的葉圓盤與載有目的基因的農桿菌液進行短期共培養(yǎng)，農桿菌通過傷口使攜帶外源目的基因的Ti或Ri質粒進入植物細胞，使外源目的基因整合到植物基因組中。它是雙子葉植物較為常用也較為簡單有效的方法。 該法轉化的健壯植株倒置浸于裝有攜帶外源目的基因的農桿菌滲入培養(yǎng)基的容器中，經真空處理，造傷，使農桿菌通過傷口感染植株，在農桿菌的介導下，發(fā)生遺傳轉化。它是一種簡便、快速、可靠而且不需要經過組織培養(yǎng)階段即可獲得大量轉化植株的基因轉移方法，具有良好的研究與應用前景。原生質體法 在原生質培養(yǎng)的早期，將攜帶外源目的基因的農桿菌與原生質體共同培養(yǎng)，農桿菌的Ti或Ri就會隨著外源信號分子的誘導而導入原生質體的核內，TDNA就可能整合在受體基因組上。此外，作為載體法，新的轉基因方法有：基于Ac/Ds轉座系統(tǒng)建立的轉化載體；利用噬菌體P1Crelox位點的特異性重組系統(tǒng)；利用酵母線粒體IScel核酸內切酶特異性誘導植物DNA雙鏈斷開引起的同源重組系統(tǒng)；利用雙鏈細菌人造染色體載體系統(tǒng)等，能夠提高轉化率或轉基因位點質量。4研究現(xiàn)狀關于禾谷類單子葉植物農桿菌介導的遺傳轉化，早期的研究多采用其幼胚來評估不同條件下被農桿菌侵染的可能性。結果顯示，TDNA向禾本科植物中的轉化沒有明顯障礙，但人們對整合過程的了解十分有限，同時存在相當大的爭議。在此基礎上，人們利用大量實驗去測試不同谷類植物的不同外植體對農桿菌侵染的反應能力，以期獲得穩(wěn)定的轉化細胞或植株。Grimsley等（1987）首先將玉米條紋病毒(maizestreakvirus)的cDNA通過根癌農桿菌轉入玉米，轉入植株表現(xiàn)出感染癥狀；Gould等（1991）用根癌農桿菌感染玉米芽尖，得到少量轉基因植株；Shen等（1993）觀察到農桿菌介導的gus基因轉入玉米芽后β葡糖苷酸酶的表達；Mooney等（1991）采用根癌農桿菌感染小麥胚得到轉化細胞；Rainer等（1990）和Chan等（1992）通過根癌農桿
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