農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法的概述(編輯修改稿)
2024-07-24 08:27 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 上剪切下來，稱T鏈。切開TDNA后，VirD2蛋白與T一鏈的5’端共價結(jié)合，避免核酸外切酶降解T一鏈．新的TDNA底鏈以此鏈為模板，從右端產(chǎn)生的DNA缺口處以5’3’方向進(jìn)行合成。被取代的舊鏈游離出來，與許多VirE2蛋白分子結(jié)合組成TDNA復(fù)合體。此外，VirD2作為一個導(dǎo)向蛋白，可以指導(dǎo)整個TDNA復(fù)合體從農(nóng)桿菌進(jìn)入到植物細(xì)胞核。TDNA整合進(jìn)入植物基因組并表達(dá)產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)．TDNA整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組，是轉(zhuǎn)化過程中最重要也最關(guān)鍵的步驟。TDNA在寄主細(xì)胞染色體上的整合是隨機的，但對轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域有所偏好。TDNA通過與事先斷裂的寄主DNA雙鏈(DSB)發(fā)生重組來完成整合，進(jìn)而進(jìn)行表達(dá)。3轉(zhuǎn)化方法 目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化單子葉植物最常用的方法是共培養(yǎng)法。利用農(nóng)桿菌與植物離體組織共培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，一般需要經(jīng)過嚴(yán)格的組織培養(yǎng)過程以再生植株，因而轉(zhuǎn)化周期比較長。共培養(yǎng)前農(nóng)桿菌感染愈傷組織的方式有：①將整塊愈傷組織浸泡于菌液中靜置培養(yǎng)。②將整塊愈傷組織浸泡于菌液中搖動培養(yǎng)。③將菌液加至愈傷組織上。通常使用的是第一種方式。現(xiàn)將農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化常采用的方法[9]，簡要介紹如下：葉盤法 選取健康的無菌苗，用打孔器打出葉圓盤，將帶有新鮮傷口的葉圓盤與載有目的基因的農(nóng)桿菌液進(jìn)行短期共培養(yǎng)，農(nóng)桿菌通過傷口使攜帶外源目的基因的Ti或Ri質(zhì)粒進(jìn)入植物細(xì)胞，使外源目的基因整合到植物基因組中。它是雙子葉植物較為常用也較為簡單有效的方法。 該法轉(zhuǎn)化的健壯植株倒置浸于裝有攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌滲入培養(yǎng)基的容器中，經(jīng)真空處理，造傷，使農(nóng)桿菌通過傷口感染植株，在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下，發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化。它是一種簡便、快速、可靠而且不需要經(jīng)過組織培養(yǎng)階段即可獲得大量轉(zhuǎn)化植株的基因轉(zhuǎn)移方法，具有良好的研究與應(yīng)用前景。原生質(zhì)體法 在原生質(zhì)培養(yǎng)的早期，將攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌與原生質(zhì)體共同培養(yǎng)，農(nóng)桿菌的Ti或Ri就會隨著外源信號分子的誘導(dǎo)而導(dǎo)入原生質(zhì)體的核內(nèi)，TDNA就可能整合在受體基因組上。此外，作為載體法，新的轉(zhuǎn)基因方法有：基于Ac/Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng)建立的轉(zhuǎn)化載體；利用噬菌體P1Crelox位點的特異性重組系統(tǒng)；利用酵母線粒體IScel核酸內(nèi)切酶特異性誘導(dǎo)植物DNA雙鏈斷開引起的同源重組系統(tǒng)；利用雙鏈細(xì)菌人造染色體載體系統(tǒng)等，能夠提高轉(zhuǎn)化率或轉(zhuǎn)基因位點質(zhì)量。4研究現(xiàn)狀關(guān)于禾谷類單子葉植物農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，早期的研究多采用其幼胚來評估不同條件下被農(nóng)桿菌侵染的可能性。結(jié)果顯示，TDNA向禾本科植物中的轉(zhuǎn)化沒有明顯障礙，但人們對整合過程的了解十分有限，同時存在相當(dāng)大的爭議。在此基礎(chǔ)上，人們利用大量實驗去測試不同谷類植物的不同外植體對農(nóng)桿菌侵染的反應(yīng)能力，以期獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植株。Grimsley等（1987）首先將玉米條紋病毒(maizestreakvirus)的cDNA通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入玉米，轉(zhuǎn)入植株表現(xiàn)出感染癥狀；Gould等（1991）用根癌農(nóng)桿菌感染玉米芽尖，得到少量轉(zhuǎn)基因植株；Shen等（1993）觀察到農(nóng)桿菌介導(dǎo)的gus基因轉(zhuǎn)入玉米芽后β葡糖苷酸酶的表達(dá)；Mooney等（1991）采用根癌農(nóng)桿菌感染小麥胚得到轉(zhuǎn)化細(xì)胞；Rainer等（1990）和Chan等（1992）通過根癌農(nóng)桿
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