【文章內容簡介】 例如根瘤菌與豆科植物的共生關系，藍藻或綠藻與真菌共生形成地衣等。有一種草履蟲，其體內有小的藻類與之共生，并能進行光合作用；過去說澳洲白蟻消化道內生活著一種所謂混毛蟲，實際由兩種螺旋體、兩種真細菌和一種纖毛蟲組成，它們能分泌有關的酶，消化纖維素。特別是近年發(fā)現的灰孢藻，它本身并無葉綠素，但有許多葉藍小體生活在體內，進行光合作用制造食物。這種共生關系看來建立不很久，因為葉藍小體在細胞內還不大固定?；益咴宓陌l(fā)現是對“內共生假說”的有力支持。（2）葉綠體和線粒體都有其獨特的 DNA，可以自行復制，不完全受核DNA 的控制。線粒體和葉綠體的 DNA 同細胞核的 DNA 有很大差別，但同細菌和藍藻的 DNA 卻很相似。藍藻的核糖體 RNA（ rRNA）不僅可以與藍藻本身的 DNA 雜交，而且還可與眼蟲葉綠體的 DNA 雜交，這些都說明它們之間的同源性。（3）線粒體和葉綠體都有自己特殊的蛋白質合成系統(tǒng)，不受核的合成系統(tǒng)的控制。原核生物的核糖體由 30S 和 50S 兩個亞基組成，真核生物的核糖體由40S 和 60S 兩個亞基組成。線粒體和葉綠體的核糖體分別與細菌和藍藻的一致，也是由 30S 和 50S 兩個亞基組成，這說明細菌和線粒體、藍藻和葉綠體是同源的?？股乜梢砸种萍毦退{藻的生長，也可以抑制真核生物中的線粒體和葉綠體的作用，這也說明線粒體與細菌、葉綠體與藍藻是同源的。 （4）線粒體、葉綠體的內、外膜有顯著差異，內、外膜之間充滿了液體。研究發(fā)現，它們內、外膜的化學成分是不同的。外膜與宿主膜比較一致，特別是和內質網膜很相似；內膜則分別同細菌和藍藻的膜相似?？傊?“內共生假說”得到了多方面的實驗支持，因而被越來越多的人所接受。 大腸桿菌與線粒體相似性線粒體在形態(tài)，染色反應、化學組成、物理性質、活動狀態(tài)、遺傳體系等方面，都很像大腸桿菌，線粒體具有獨立的轉錄翻譯體系，線粒體有其獨立的rRNA，tRNA，核糖體等可以用來表達的基因。這些成分與細胞質相應成分不同，第一章 引言5而與細菌的比較相似，不受細胞核控制，且與大腸桿菌一樣都具有多順反子的轉錄線粒體遺傳體系和大腸桿菌有很多相似的地方，如：（1）DNA 結構為環(huán)狀，無內含子；（2）核糖體為 70S 型；（3）RNA 聚合酶不被放線菌素 D 所抑制，溴化乙錠可抑制；（4）氨?；鵷RNA 合成酶、tRNA 與細胞質中不相同；（5）N甲酰甲硫氨酰 tRNA 是蛋白質合成的起始氨?；?tRNA，其對細菌蛋白質合成的抑制劑氯霉素敏感而對細胞質蛋白合成的抑制劑放線菌酮則不敏感。近年來，科學家發(fā)現了原核生物的質膜上存在著與線粒體內膜上結構保守和功能相似的呼吸電子傳遞鏈復合體（I，II，III，IV 和 V） 。所以本文用大腸桿菌代替線粒體，現在沒有技術研究線粒體，而線粒體和大腸桿菌有類似的地方，本實驗就是將不育基因導入大腸桿菌中來研究。 丙酮酸激酶與線粒體的關系線粒體由兩層膜包被，外膜平滑，內膜向內折疊形成嵴，兩層膜之間有腔，線粒體中央是基質?；|內含 有與三羧酸循環(huán)所需的全部酶類，內膜上具有呼吸鏈酶系及 ATP 酶復合體。線粒體能為細胞的生命活動提供場所，是細胞內 氧化磷酸化和形成 ATP 的主要場所，有細胞“動力工廠 ”(power plant)之稱。線粒體有自身的 DNA 和遺傳體系，但線粒體基因 組的基因數量有限，因此，線粒體只是一種半自主性的細胞器。線粒體是真核生物進行氧化代謝的部位，是糖類、脂肪和氨基酸最終氧化釋放能量的場所。線粒體負責的最終氧化的共同途徑是三羧酸循環(huán)與氧化磷酸化，分別對應有氧呼吸的第二、三階段。丙酮酸激酶使磷酸烯醇式丙酮酸和 ADP 變?yōu)?ATP 和丙酮酸，是糖酵解過程中的主要限速酶之一，是有氧呼吸的關鍵酶，是能量呼吸過程中重要的酶，一般認為,丙酮酸激酶活性受參與糖酵解的物質,如磷酸烯醇式丙酮酸、1,6二磷酸果糖和中間產物等幾種物質調節(jié),它們都能增加丙酮酸激酶的活性。因此,糖酵解的速度正相關于以上幾種物質的含量。丙酮酸激酶是作為糖酵解的重要限制酶之一，影響糖酵解的速度，從而影響有氧呼吸作用。線粒體又是細胞能量過程重要場所，丙酮酸激酶對于線粒體中反應過程中具有重要的作用。 研究目的與意義植物細胞質雄性不育在雜種優(yōu)勢利用上的重要價值一直是人們研究的熱點，第一章 引言6并且是研究核質互作的好材料，對了解植物生命活動機制有重要意義。然而，植物細胞質雄性不育因其自身的表型特異性，活性線粒體體外操作與培養(yǎng)的技術瓶頸嚴重阻滯了 CMS 分子機理的研究。至今為止，細胞質雄性不育的分子機理仍不清楚。本課題以大腸桿菌這一與線粒體類似的遺傳體系來系統(tǒng)的研究水稻紅蓮型雄性不育基因 orfH79 對大腸桿菌抑制機理，同時避開了線粒體體外培養(yǎng)的難題，為研究 CMS 分子機理提供了一個新的思路。 本課題研究的是雄性不育基因orfH79 對大腸桿菌上丙酮酸激酶的影響，是通過測過 orfH79 基因轉化大腸桿菌丙酮酸激酶的酶活測定實現的。第二章 材料與方法7第二章 材料和方法 實驗材料與試劑 菌株與培養(yǎng)基1）菌株。構建原核表達載體的工程菌株為 pET28a 和 BL21 均在本實驗室80℃保存。2）培養(yǎng)基。LB 培養(yǎng)基（1L）：胰化蛋白胨 10g，氯化鈉 10g，酵母提取物5g，加入去離子水至 1000ml，用 5mol/LnaOH 調整 PH 至 。121℃高壓滅菌20min。配置 LB 固體培養(yǎng)基時，調整 PH 后加入瓊脂粉（ 15g/L）即可。 試劑配制1）9% 的生理鹽水： 的氯化鈉定容至 200ml 的溶液2）南京建成公司 PK 試劑盒：試劑一：液體 60ml1 瓶，4℃保存。試劑二：粉劑2 支，20℃保存，每支用時加蒸餾水 ，用不完的放20℃以下，可保存 37 天。 （如果樣品量少，可以將 再分成 23 管放20℃以下保存，每次取一管用，以免反復凍融） 。試劑三：液體4 支，4℃保存，用不完的仍放 4℃—8℃保存。試劑四：粉劑4 支，20℃保存，用時每支加蒸餾水 320ul，用不完的試劑放20℃以下保存。試劑五：粉劑4 支，20℃保存，用時每支加蒸餾水 650ul，用不完的試劑放20℃以下保存。3）蛋白定量測試盒（100T/96 樣）：試劑一：考馬斯亮藍備液，60ml1 瓶，4℃保存 6 個月?？捡R斯亮藍顯色液的配制：按考馬斯亮藍貯備液：雙蒸水=1:4 的比例進行配制（即 5 倍稀釋） ，用多少配多少，現用現配。試劑二：蛋白標準，1 支，4℃保存 1 個月（如要延長時間將標準液分裝后20℃冷凍保存 6 個月）4）蛋白提取裂解液（10ml）：8mol/L 尿素，2mol/L 硫脲，4%(w/v)CHAPS，l%(w/v)DTT，%(w/v)，35mmol/LTris，5mmol/LEDTA。臨用前加入，100ul PMSF 以及 80ul 兩性電解質 PH310。第二章 材料與方法85) 蛋白提取緩沖液:， 主要儀器儀器名稱 生產廠家冷凍高速離心機MilliQ 超純水系統(tǒng)超低溫冰箱分光光度計超聲波細胞粉碎儀搖床生化培養(yǎng)箱立式滅菌鍋分析天平酸度計超凈工作臺快速混勻器SIGMA 公司Millipore 公司Thermo 公司上海光譜分析儀器廠寧波新芝公司Sanyo 公司Sanyo 公司杭州匯爾儀器公司Eppendorf 公司上海同卡實業(yè)有限公司蘇州凈化有限公司 試驗方法 細菌蛋白提取1）取活化的 pET28aorfH79 和 pET28a BL21 表達菌株，按 1%接種于 50mlLB培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)（37℃、200rpm） 。2）每隔一段時間測其光密度 OD600nm 時的吸光值，當 OD 值為 時，在培養(yǎng)基中加入 50Μl IPTG，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。3）一個錐形瓶中的 pET28aorfH79 BL21 表達菌株培養(yǎng)六小時即 Na6 菌種，第二個錐形瓶中的 pET28aorfH79 BL21 表達菌株即 Na12 菌種，第三個錐形瓶中pET28a BL21 表達菌株培養(yǎng) 12 小時即 28a 菌種，將菌體轉移至離心管中，以 6000rpm 冰凍離心 10min，收集菌體。4）菌體使用緩沖液懸浮洗滌 3 次，離心（10000rpm ）收集菌體。5）菌體轉移到容器中，加入 5ml 裂解液，充分混勻。6）冰浴超聲 5min（200w、15sec 脈沖、30sec 停止） 。7）取出細胞裂解液，以 14000rpm 冰凍離心 15min，收集上清。第二章 材料與方法9 測蛋白濃度1）操作表：按操作表Ⅰ的步驟進行操作?？瞻坠?標準管 測定管雙蒸水（ml）（ml）樣品（ml）考馬斯亮藍