生物化學(xué)蛋白質(zhì)(2)-文庫吧資料
2025-01-22 14:41本頁面
【正文】 法 凝膠過濾層析也稱為分子篩層析，可以對含有不同大小分子的混合物進行分離。 密度梯度離心法是在離心管中通過某種介質(zhì)來提供一個密度梯度環(huán)境，然后加入待分離的物質(zhì)，通過離心的方法達到分離的目的。 （ 1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法 離心分離是利用離心慣性力的作用分離非均相混合物的方法。 2．蛋白質(zhì)分離純化的常用方法 （ 1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法 （ 2）利用溶解度差別的純化方法 （ 3）根據(jù)電荷不同的純化方法 （ 4）利用選擇性吸附的純化方法 （ 5）利用對配體的特異親和力的純化方法 （ 1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法 ①透析法 ②超濾法 ③離心法 ④凝膠過濾法 （ 1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法 血液透析 小分子溶出 小分子被帶出 透析機 透析液 血液 加壓 ①透析 透析法是利用蛋白質(zhì)的分子比較大，不能透過半透膜的特點，實現(xiàn)蛋白質(zhì)與小分子物質(zhì)分離的方法。 （ 3）蛋白質(zhì)粗制品的獲得 常用的方法有：層析法（凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等）；電泳法和超離心法等。 抽提所用緩沖液的 pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應(yīng)根據(jù)欲制備蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。 常用下列幾種方法：等電點沉淀法、鹽析法、有機溶劑沉淀法。 （ 1）材料的預(yù)處理及細胞破碎 選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分離開來，首先獲得蛋白質(zhì)粗制品。 常用的破碎方法有：機械破碎法、滲透破碎法、反復(fù)凍融法（對溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法）、超聲波法和酶法等。 （ 4）高效（高壓）液相色譜 氨基酸的高效液相色譜圖 二、蛋白質(zhì)的分離和純化 1．蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟 2．蛋白質(zhì)分離純化的常用方法 1．蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟 （ 1）材料的預(yù)處理及細胞破碎 （ 2）蛋白質(zhì)的抽提 （ 3）蛋白質(zhì)粗制品的獲得 （ 4）樣品的進一步分離純化 （ 1）材料的預(yù)處理及細胞破碎 預(yù)處理的主要目的是去除原材料中的部分可溶性雜質(zhì)，分離含有蛋白的細胞。 HPLC適用于分析分離不易揮發(fā)的極性物質(zhì)。 （ 4）高效（高壓）液相色譜 液相色譜法是以液體為載體，將樣品帶入色譜儀進行分析的方法。 而帶有負電荷的稱之為陽離子樹脂。 （ 3）離子交換層析 （ 3）離子交換層析 常用于氨基酸分離的離子交換劑是樹脂。 分離原理是在一定離子強度和 pH等條件下，由于樣品中目標純化分子和雜質(zhì)分子與吸附劑之間的吸附與解吸能力不同，達到分離純化目標分子的目的。 根據(jù)分離的原理不同，薄層層析可以分為 吸附薄層層析和分配薄層層析 兩類。 Rf也就是原點到層析斑點（即原色點）中心的距離 (DA)與原點到溶劑前沿的距離（ Ds）的比值。 （ 1）紙層析 氨基酸的混合物點在濾紙的一個角上，把這個點稱為原點。 （ 1）紙層析 層析時，混合氨基酸在水和有機相之間不斷進行分配，使它們分布在濾紙的不同位置，從而使物質(zhì)得到分離和提純。 紙層析以濾紙為隋性支持物，濾紙纖維和水有較強的親和力，在一般條件下較難脫去，而濾紙纖維與有機溶劑的親和力甚弱，所以紙層析的 固定相是被濾紙纖維吸附的結(jié)合水 。 1．層析法的基本原理 利用層析法分離混合物，例如氨基酸混合物，其先決條件是各種氨基酸成分的分配系數(shù)要有差異 ，哪怕是很小的差異，一般差異越大，越容易分開。 ?基本原理： 所有的層析系統(tǒng)通常都為兩個相組成 。 應(yīng)用 :可以用此反應(yīng)來定性測定蛋白質(zhì)；也可在 540nm處比色，定量測定蛋白質(zhì)。 氨基酸所沒有的一些顏色反應(yīng)，主要是 雙縮脲反應(yīng) ，是蛋白質(zhì)常用的定量分析方法。 五、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)是指利用蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或利用肽鍵、以及酚基等特殊氨基酸殘基的特性，使其與一些試劑發(fā)生反應(yīng)而生成有色物質(zhì)。 蛋白質(zhì)的復(fù)性是一個十分復(fù)雜的過程，除了要去除變性因素，多數(shù)蛋白還需要一些 其他因素的協(xié)助 來恢復(fù)蛋白質(zhì)的正確折疊。 ③一些理化性質(zhì)改變 。 ②某些側(cè)鏈基團暴露出來 。 物理因素有加熱（ 70～ 100℃ ）、劇烈振蕩或攪拌、紫外線及 X射線照射、超聲波等。 1．蛋白質(zhì)變性的概念 2．蛋
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