【正文】 析液，在毛細拉力的作用下，層析液能不斷由下向上流動。 高效液相色譜（ HPLC）采用了高壓泵、高效分離柱、高靈敏度檢測器等，使分離效能、分析速度、檢測靈敏度比經典液相色譜有了很大的提高。 （ 1）根據(jù)蛋白質分子大小不同的純化方法 ②超濾 利用一定的壓力使樣品通過半透膜，這時，小分子和水組成的溶質可以被濾過，而大分子的蛋白質則留在膜內，這種方法稱為超濾法，亦稱微濾法。 （ 2）利用溶解度差別的純化方法 與水混溶的有機溶劑能減少水和蛋白質間的作用力，使蛋白質脫水。 （ 5）利用對配體的特異親和力的純化方法 親和色譜顆粒 三、蛋白質的定量檢測 1．凱氏定氮法 2．紫外 分光光度計法 3．雙縮脲法（ Biuret法） 4． Folin酚試劑法（ Lowry法） 5．考馬斯亮藍 G250染色法（ Bradford法） 6． BCA法 1．凱氏定氮法 ?原理： 氮在蛋白質分子中含量恒定 （ 平均占 16%） ， 因此測出樣品中氮的含量后 ， 即可求得樣品中蛋白質含量 。 ?因此 ， 可用 BCA法來測定蛋白質含量 。 ?免疫化學法是鑒定蛋白質純度的有效方法， 它根據(jù)抗原與抗體反應的特異性 ， 可用已知抗體檢查抗原或已知抗原檢查抗體 。 其顏色在595nm的光波下 ， 有強烈吸收峰 。 硅膠、氧化鋁、活性炭等物質為固體吸附劑，能夠將其它分子吸附在表面。 （ 2）利用溶解度差別的純化方法 當溶液的 pH與蛋白質的等電點相同時，蛋白質分子呈現(xiàn)電中性，分子間無斥力，分子易于積聚和沉淀，此時蛋白質的溶解度是最小的，這種使蛋白質沉淀的方法稱為 等電點沉淀。 在抽提過程中，應注意選擇合適的溫度條件，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。帶有正電荷的樹脂稱之為陰離子交換樹脂。 一個為固定相的或靜相；一個為流動相或動相 。 化學因素有強酸、強堿、尿素、胍、去污劑、重金屬鹽、三氯醋酸、磷鎢酸、苦味酸、濃乙醇等。 1．鹽析和鹽溶法 鹽析： 向蛋白質溶液中加入高濃度的中性鹽，可有效地破壞蛋白質顆粒的水化層，同時中和了蛋白質的電荷，降低了蛋白質的溶解度，從而使蛋白質沉淀。 蛋白質溶液也具有布朗運動、丁達爾效應以及不能透過半透膜等性質。 4．生物堿試劑以及某些酸 類沉淀蛋白質 某些生物堿試劑（如苦味酸、鎢酸、鞣酸、碘化鉀等）及某些酸（三氯乙酸、水楊磺酸、硝酸等）與蛋白質結合成不溶性的鹽沉淀。 五、蛋白質的顏色反應 蛋白質的顏色反應是指利用蛋白質的結構或利用肽鍵、以及酚基等特殊氨基酸殘基的特性，使其與一些試劑發(fā)生反應而生成有色物質。 Rf也就是原點到層析斑點（即原色點）中心的距離 (DA)與原點到溶劑前沿的距離（ Ds）的比值。 常用的破碎方法有：機械破碎法、滲透破碎法、反復凍融法（對溫度變化敏感的蛋白質不宜采用此法）、超聲波法和酶法等。 （ 1）根據(jù)蛋白質分子大小不同的純化方法 ③離心法 （ 1）根據(jù)蛋白質分子大小不同的純化方法 凝膠過濾層析也稱為分子篩層析，可以對含有不同大小分子的混合物進行分離。 十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSPAGE）可以完全依據(jù)蛋白質的相對分子質量，來對蛋白質進行分離。 ?雙縮脲法的測定范圍為 1~10 mg蛋白質 。 ?在紙上電泳為一條區(qū)帶的樣本 ， 在聚丙烯酰胺凝膠泳時 ， 可能分成數(shù)條區(qū)帶；如結合等電聚集電泳則更可提高分辯力 ， 很容易檢出微量雜蛋白質的混存 。 ?若為兩種分子量不同的蛋白質混合時 ，則形成二條分界線 。 4． Folin酚試劑法（ Lowry法） ?又叫 Lowry法 ?其原理是堿性銅試劑與蛋白質發(fā)生 雙縮脲反應 ，然后蛋白質中的酚基 （ 如酪氨酸 ） 在堿性條件下很容易將混合試劑 （ 含有磷鉬酸和磷鎢酸 ） 還原或藍色的鉬藍和鎢藍 ， 其顏色的深淺與蛋白質含量成正比 ， 在 650~660nm下測定光吸收值 ， 即可測定蛋白質含量 。 ①電泳 SDSPAGE電泳示意圖 ①電泳 等電聚焦在等電聚焦時，蛋白質分子是在含有載體兩性電解質形成的一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性 pH梯度中進行電泳。 分離過程是基于蛋白質在自由流動溶劑和存在于多孔凝膠中的固定溶劑間的分配。