生物化學(xué)蛋白質(zhì)(2)-全文預(yù)覽
【正文】 （ 2）利用溶解度差別的純化方法 （ 3）根據(jù)電荷不同的純化方法 （ 4）利用選擇性吸附的純化方法 （ 5）利用對配體的特異親和力的純化方法 （ 1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法 ①透析法 ②超濾法 ③離心法 ④凝膠過濾法 （ 1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法 血液透析 小分子溶出 小分子被帶出 透析機(jī) 透析液 血液 加壓 ①透析 透析法是利用蛋白質(zhì)的分子比較大，不能透過半透膜的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)與小分子物質(zhì)分離的方法。 抽提所用緩沖液的 pH、離子強(qiáng)度、組成成分等條件的選擇應(yīng)根據(jù)欲制備蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。 （ 1）材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎 選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分離開來，首先獲得蛋白質(zhì)粗制品。 （ 4）高效（高壓）液相色譜 氨基酸的高效液相色譜圖 二、蛋白質(zhì)的分離和純化 1．蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟 2．蛋白質(zhì)分離純化的常用方法 1．蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟 （ 1）材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎 （ 2）蛋白質(zhì)的抽提 （ 3）蛋白質(zhì)粗制品的獲得 （ 4）樣品的進(jìn)一步分離純化 （ 1）材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎 預(yù)處理的主要目的是去除原材料中的部分可溶性雜質(zhì)，分離含有蛋白的細(xì)胞。 （ 4）高效（高壓）液相色譜 液相色譜法是以液體為載體，將樣品帶入色譜儀進(jìn)行分析的方法。 （ 3）離子交換層析 （ 3）離子交換層析 常用于氨基酸分離的離子交換劑是樹脂。 根據(jù)分離的原理不同，薄層層析可以分為 吸附薄層層析和分配薄層層析 兩類。 （ 1）紙層析 氨基酸的混合物點(diǎn)在濾紙的一個(gè)角上，把這個(gè)點(diǎn)稱為原點(diǎn)。 紙層析以濾紙為隋性支持物，濾紙纖維和水有較強(qiáng)的親和力，在一般條件下較難脫去，而濾紙纖維與有機(jī)溶劑的親和力甚弱，所以紙層析的 固定相是被濾紙纖維吸附的結(jié)合水 。 ?基本原理： 所有的層析系統(tǒng)通常都為兩個(gè)相組成 。 氨基酸所沒有的一些顏色反應(yīng)，主要是 雙縮脲反應(yīng) ，是蛋白質(zhì)常用的定量分析方法。 蛋白質(zhì)的復(fù)性是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，除了要去除變性因素，多數(shù)蛋白還需要一些 其他因素的協(xié)助 來恢復(fù)蛋白質(zhì)的正確折疊。 ②某些側(cè)鏈基團(tuán)暴露出來 。 1．蛋白質(zhì)變性的概念 2．蛋白質(zhì)變性的誘因與結(jié)果 能使蛋白質(zhì)變性的因素很多，可分為化學(xué)因素和物理因素兩大類。 5．加熱凝固 將接近于等電點(diǎn)附近的蛋白質(zhì)溶液加熱可使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固而沉下。 3．重金屬鹽沉淀法 pH稍大于等電點(diǎn)為宜，因?yàn)榇藭r(shí)蛋白質(zhì)帶負(fù)電，易與金屬離子結(jié)合成鹽。 2．有機(jī)溶劑沉淀法 可與水混合的有機(jī)溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等能破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)而使蛋白質(zhì)沉淀。 1．鹽析和鹽溶法 鹽析 蛋白質(zhì)分子表面聚集了許多水分子，當(dāng)鹽濃度高時(shí)，水分子被鹽抽出，蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域暴露并相互結(jié)合，沉淀。 利用蛋白質(zhì)不能透過半透膜的性質(zhì)發(fā)展了的另一蛋白質(zhì)純化方法 — 超濾。 二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 分散相質(zhì)點(diǎn)小于 1 nm時(shí)稱為真溶液，分散相質(zhì)點(diǎn)大于 100 nm時(shí)稱為懸濁液，而分散相質(zhì)點(diǎn)在 1~100 nm之間時(shí)稱為膠體溶液。 一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì) 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一 pH值時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正離子和負(fù)離子的趨勢相等，為兼性離子，即總凈電荷為零，此時(shí)在電場中，蛋白質(zhì)分子既不向陽極移動(dòng)，也不向陰極移動(dòng)，這個(gè) pH值稱為 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) ，用 pI來表示。 二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 利用蛋白質(zhì)不能透過半透膜的性質(zhì)，常將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液放入透析袋中，置于流水中逐漸將小分子雜質(zhì)除去，起到純化的目的，這種方法即為 透析。 蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用加強(qiáng)，因而溶解度提高。因其溶解度大，且不易傷害蛋白質(zhì)，另外還有硫酸鈉、硫酸鎂及氯化鈉等。其優(yōu)點(diǎn)在于：不像鹽析那樣存在有大量鹽類，必須經(jīng)透析除去，而且有機(jī)溶劑很易通過稀釋透析及蒸發(fā)等方法除去。 沉淀?xiàng)l件應(yīng)當(dāng)是 pH小于等于電點(diǎn)，這樣蛋白質(zhì)帶正電，易與酸根負(fù)離子結(jié)合成鹽。 蛋白質(zhì)變性作用的 實(shí)質(zhì)是維持蛋白質(zhì)分子高級結(jié)構(gòu)的次級鍵和二硫鍵被破壞 ，引起天然構(gòu)象解體，但維持主鏈的共價(jià)鍵－肽鍵并未被打斷，即一級結(jié)構(gòu)保持完好。 2．蛋白質(zhì)變性的誘因與結(jié)果 蛋白質(zhì)變性
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