生物化學(xué)蛋白質(zhì)(2)(編輯修改稿)
2025-02-12 14:41 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 溶解性能（即分配）或者其它親和作用性能的差異，使混合物溶液中的各種物質(zhì)，進(jìn)行反復(fù)的吸附或者分配等作用，從而將各種組分分開。 根據(jù)分離的原理不同，薄層層析可以分為 吸附薄層層析和分配薄層層析 兩類。 （ 2）薄層層析 （ 3）離子交換層析 離子交換層析是一種用離子交換劑作為支持劑的層析方法。 分離原理是在一定離子強(qiáng)度和 pH等條件下，由于樣品中目標(biāo)純化分子和雜質(zhì)分子與吸附劑之間的吸附與解吸能力不同，達(dá)到分離純化目標(biāo)分子的目的。 一般需經(jīng)過加樣、吸附、洗滌、洗脫和凝膠再生幾個(gè)環(huán)節(jié)。 （ 3）離子交換層析 （ 3）離子交換層析 常用于氨基酸分離的離子交換劑是樹脂。帶有正電荷的樹脂稱之為陰離子交換樹脂。 而帶有負(fù)電荷的稱之為陽離子樹脂。它們分別和不同帶電性質(zhì)的離子基團(tuán)發(fā)生離子交換。 （ 4）高效（高壓）液相色譜 液相色譜法是以液體為載體，將樣品帶入色譜儀進(jìn)行分析的方法。 高效液相色譜（ HPLC）采用了高壓泵、高效分離柱、高靈敏度檢測(cè)器等，使分離效能、分析速度、檢測(cè)靈敏度比經(jīng)典液相色譜有了很大的提高。 HPLC適用于分析分離不易揮發(fā)的極性物質(zhì)。 （ 4）高效（高壓）液相色譜 高效液相色譜儀由高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)等五大部分組成。 （ 4）高效（高壓）液相色譜 氨基酸的高效液相色譜圖 二、蛋白質(zhì)的分離和純化 1．蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟 2．蛋白質(zhì)分離純化的常用方法 1．蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟 （ 1）材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎 （ 2）蛋白質(zhì)的抽提 （ 3）蛋白質(zhì)粗制品的獲得 （ 4）樣品的進(jìn)一步分離純化 （ 1）材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎 預(yù)處理的主要目的是去除原材料中的部分可溶性雜質(zhì)，分離含有蛋白的細(xì)胞。 分離提純某一種蛋白質(zhì)時(shí)，首先要采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。 常用的破碎方法有：機(jī)械破碎法、滲透破碎法、反復(fù)凍融法（對(duì)溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法）、超聲波法和酶法等。機(jī)械破碎法是最常用的細(xì)胞破碎方法 。 （ 1）材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎 選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分離開來，首先獲得蛋白質(zhì)粗制品。 方便有效的方法是根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進(jìn)行分離。 常用下列幾種方法：等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法。 （ 2）蛋白質(zhì)的抽提 選擇適當(dāng)?shù)木彌_液把蛋白質(zhì)提取出來，即為蛋白質(zhì)的抽提。 抽提所用緩沖液的 pH、離子強(qiáng)度、組成成分等條件的選擇應(yīng)根據(jù)欲制備蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。 在抽提過程中，應(yīng)注意選擇合適的溫度條件，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質(zhì)的變性。 （ 3）蛋白質(zhì)粗制品的獲得 常用的方法有：層析法（凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等）；電泳法和超離心法等。 有時(shí)還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品 。 2．蛋白質(zhì)分離純化的常用方法 （ 1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法 （ 2）利用溶解度差別的純化方法 （ 3）根據(jù)電荷不同的純化方法 （ 4）利用選擇性吸附的純化方法 （ 5）利用對(duì)配體的特異親和力的純化方法 （ 1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法 ①透析法 ②超濾法 ③離心法 ④凝膠過濾法 （ 1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法 血液透析 小分子溶出 小分子被帶出 透析機(jī) 透析液 血液 加壓 ①透析 透析法是利用蛋白質(zhì)的分子比較大，不能透過半透膜的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)與小分子物質(zhì)分離的方法。 （ 1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法 ②超濾 利用一定的壓力使樣品通過半透膜，這時(shí)，小分子和水組成的溶質(zhì)可以被濾過，而大分子的蛋白質(zhì)則留在膜內(nèi)，這種方法稱為超濾法，亦稱微濾法。 （ 1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法 離心分離是利用離心慣性力的作用分離非均相混合物的方法。 由于懸浮液中顆粒的沉降速率不僅取決于顆粒本身的性質(zhì)，而且也取決于懸浮顆粒介質(zhì)以及作用在顆粒上的力，因此常采用密度梯度離心法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。 密度梯度離心法是在離心管中通過某種介質(zhì)來提供一個(gè)密度梯度環(huán)境，然后加入待分離的物質(zhì)，通過離心的方法達(dá)到分離的目的。 ③離心法
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