生物化學(xué)蛋白質(zhì)(2)(參考版)
2025-01-19 14:41本頁面
【正文】 。 6．化學(xué)分析法 ?應(yīng)用化學(xué)分析方法測定純化了的蛋白質(zhì)試樣中的某種成分的比值 ， 從而可以判斷蛋白質(zhì)的純度 。 5．分光光度法 ?蛋白質(zhì)的最大吸收峰在 280mm， 核酸在260mm， 若兩者比值為 ， 表示為純蛋白質(zhì) （ OD280/ OD 260=） 。 ?若為兩種分子量不同的蛋白質(zhì)混合時 ，則形成二條分界線 。 ?在紙上電泳為一條區(qū)帶的樣本 ， 在聚丙烯酰胺凝膠泳時 ， 可能分成數(shù)條區(qū)帶；如結(jié)合等電聚集電泳則更可提高分辯力 ， 很容易檢出微量雜蛋白質(zhì)的混存 。 ?不純蛋白質(zhì)的溶解度曲線常常呈現(xiàn)兩個或兩個以上的折點 。 四、蛋白質(zhì)的純度分析 1．溶解度分析 2．電泳法 3．超離心沉降法 4．免疫學(xué)方法 5．分光光度法 6．化學(xué)分析法 1．溶解度分析 ?單一蛋白質(zhì)的溶解度曲線不因加入過量的試樣而改變 。 ?在堿性溶液中 ， 蛋白質(zhì)將二價銅離子還原成一價銅離子 ， 一價銅離子與測定試劑中的 BCA形成一個在 562 nm處具有最大光吸收的紫色復(fù)合物 ， 該復(fù)合物的光吸收強度與蛋白質(zhì)濃度呈正比 。 ?常用此反應(yīng)來定量測定蛋白質(zhì)含量 。 5．考馬斯亮藍(lán) G250染色法 （ Bradford法） ?用考馬思亮蘭 G250染色蛋白質(zhì) ， 出現(xiàn)的顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比 。 蛋白質(zhì)測量范圍在25~250mg/ml， 因此是通用的方法之一 。 4． Folin酚試劑法（ Lowry法） ?又叫 Lowry法 ?其原理是堿性銅試劑與蛋白質(zhì)發(fā)生 雙縮脲反應(yīng) ，然后蛋白質(zhì)中的酚基 （ 如酪氨酸 ） 在堿性條件下很容易將混合試劑 （ 含有磷鉬酸和磷鎢酸 ） 還原或藍(lán)色的鉬藍(lán)和鎢藍(lán) ， 其顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量成正比 ， 在 650~660nm下測定光吸收值 ， 即可測定蛋白質(zhì)含量 。 ?雙縮脲法的測定范圍為 1~10 mg蛋白質(zhì) 。 3．雙縮脲法（ Biuret法） ?包含肽鍵基團(tuán)的化合物能與硫酸銅 氫氧化鈉溶液產(chǎn)生 雙縮脲顏色反應(yīng) ， 生成紫紅色或藍(lán)紫色的復(fù)合物 。 ?每克樣品中含氮的克數(shù) 100=100克樣品中蛋白質(zhì)的含量 （ 克 %） 。 配體： 指能與某些蛋白質(zhì)進(jìn)行特異結(jié)合的化合物 ， 如配體的作用物及抑制劑、 激素和受體 、 抗原和抗體 、 酶及底物等 。 吸附層析的分離效果，決定于吸附劑、溶劑和蛋白質(zhì)的性質(zhì)三個因素。 ②離子交換層析 R CH COOH NH3+ +M1A+ R CH COOH NH3M1 +A+ 氨基酸（在酸性溶液中） 陽離子交換劑 氨基酸鹽 R CH COO－ NH2 +M2B － R CH COO M2 NH2 + B － 氨基酸（在堿性溶液中） 陰離子交換劑 氨基酸鹽 M1為酸性基團(tuán)， M2為堿性基團(tuán) （ 4）利用選擇性吸附的純化方法 吸附層析是利用待純化的分子和雜質(zhì)分子與吸附劑之間的吸附能力和解吸性質(zhì)不同，達(dá)到使它們分離的目的。 ②離子交換層析 是用離子交換樹脂作支持劑的一種層析法 。 ①電泳 SDSPAGE電泳示意圖 ①電泳 等電聚焦在等電聚焦時，蛋白質(zhì)分子是在含有載體兩性電解質(zhì)形成的一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性 pH梯度中進(jìn)行電泳。 十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSPAGE）可以完全依據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量，來對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。利用帶電粒子在電場中移動速度不同而使目標(biāo)分子分離的技術(shù)稱為電泳技術(shù)。 有機溶劑的加入能降低溶液的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子間的作用力增強，蛋白質(zhì)分子易于聚集沉淀。 鹽析現(xiàn)象。 不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點，利用這一特性，可以通過改變?nèi)芤旱?pH，使要分離的蛋白質(zhì)沉降出來，這些蛋白質(zhì)仍然能夠保持天然的生物學(xué)活性，該方法可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)的粗分離。 ③溶劑的極性同樣會影響蛋白質(zhì)的溶解度。 （ 2）利用溶解度差別的純化方法 ①溶液的 pH會影響蛋白質(zhì)的溶解度。 分離過程是基于蛋白質(zhì)在自由流動溶劑和存在于多孔凝膠中的固定溶劑間的分配。 （ 1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法 ③離心法 （ 1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方
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