生物化學蛋白質(zhì)環(huán)境(參考版)
2025-07-28 15:31本頁面
【正文】 序列測定前的準備工作 : 樣品的純度 :97%以上 ,可用電泳的方法檢查 肽鏈的數(shù)目 :兩條或兩條以上要拆開 一級結(jié)構(gòu)測定主要用小片段重疊的原理 : 蛋白質(zhì)分子中氨基酸序列的確定 1）肽鏈的拆開和分離 共價鍵 :最常見的是 SS鍵 ,可用巰基化合物還原 ,如巰基乙醇 ,也可用過甲酸 . 非共價鍵 :可用變性劑 8M尿素或 6M鹽酸胍或濃鹽溶液處理 序列測定的步驟 : N端分析方法 : (1)二硝基氟苯法 (DNP法或 DNFB法 ) (2)丹磺酰氯法 (DNS法 ) 這兩種方法 ,水解后 ,只有與試劑連接的 N端氨基酸沒被水解 ,其余的氨基酸殘基全部被水解下來 (3)苯異硫氰酸酯法 (PITC法 ) 水解后 ,僅靠近 PITC的 N端氨基酸斷裂下來產(chǎn)生 PITC氨基酸并環(huán)化 ,其后的氨基酸可以繼續(xù)反應分析 ,取決于反應試劑的純度和反應產(chǎn)率 . (4)氨肽酶法 :專一性不夠高 ,從 N端開始每次釋放一個氨基酸殘基 . 2）末端分析 :包括 N端分析和 C端分析 N端氨基酸封閉的幾種情況 : (1)N端乙?；? (2)環(huán)肽 (3)N端的谷氨酰胺環(huán)化成焦谷氨酰胺 C端分析 : (1)硼氫化鋰還原法 羧基 → 羥基 → 混合氨基酸 +羥胺 (C端 ) (2)肼解法 :也稱聯(lián)氨法 (加入無水 NH2NH2,100℃ ) 肽鏈 → (n1)氨基酸酰肼 +C端氨基酸 (離子交換 ) (3)羧肽酶法 羧肽酶 來源 專一性 CPA 胰臟 除 Pro,Arg和 Lys以外所有 C端 AA CPB 胰臟 只水解 C端為 Arg或者 Lys的肽鍵 CPC 植物或微生物 幾乎所有氨基酸 CPY 面包酵母 幾乎所有氨基酸 3 ）肽鏈的部分水解 化學方法 : (1)溴化氰 (CNBr)裂解法 :溴化氰作用于甲硫氨酸的羧基形成的肽鍵 ,一般蛋白質(zhì)中含甲硫氨酸較少 ,此法水解后 ,可得到較大的肽段 . (2)羥胺 (NH2OH)裂解法 主要裂解 AsnGly間的肽鍵 , AsnLeu及 AsnAla也部分裂解 . 酶解法 : (1)胰蛋白酶 (Trypsin) 作用于堿性氨基酸如 ,但右邊不能是 Pro (2)胰凝乳蛋白酶 (糜蛋白酶 Chymotrypsin) 作用于芳香族氨基酸 ,如 Phe,Trp,Tyr的羧基形成的肽鍵 ,但右邊不能是 Pro (3)嗜熱菌蛋白酶 : 作用于 Ile,Met,Phe,Trp,Tyr,Val等芳香族和疏水性氨基酸的氨基形成的肽鍵 ,但右邊不能是 Pro (4)彈性蛋白酶 作用于小的中性氨基酸的羧基形成的肽鍵 ,如Ala,Gly,Ser,Val (5)胃蛋白酶 作用于 Leu,Phe,Trp的氨基形成的肽鍵 ,但左邊不能是 Pro (6)V8酶 作用于 Glu的羧基形成的肽鍵 4）肽段的分離和氨基酸序列的測定 可用離子交換層析和凝膠過濾兩種方法分離 蛋白質(zhì)序列測定儀測定氨基酸序列 5） 找重疊肽從而推斷出整個肽鏈的氨基酸序列 如 : N末端殘基 H C末端殘基 S 第一套肽段 :OUS,PS,EOVE,RLA,HOWT 第二套肽段 :SEO,WTOU,VERL,APS,HO 借助重疊肽確定肽段次序 : 末端殘基 : H S 末端肽段 : HOWT OUS APS 第一套肽段 HOWT OUS EOVE RLA PS 第二套肽段 HO WTOU SEO VERL APS 推斷全序列 HOWTOUSEOVERLAPS 6 ） 二硫鍵位置的確定 對角線電泳法 : 先用胃蛋白酶水解 ,分成小肽 ,點樣在濾紙中央 ,進行第一向電泳 ,電泳完畢 ,將濾紙暴露在過甲酸蒸汽中 ,使 SS鍵斷裂 ,轉(zhuǎn) 90176。 親和層析 這是根據(jù)蛋白質(zhì)能與特異的配體相結(jié)合而設計的一種方法。 2）離子交換層析 離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的不同進行分離純化。 （ 2） 根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小進行分離 2）凝膠過濾 ? 也稱分子排阻層析 ,分子篩層析 ,這是 根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小不同來分離純化蛋白質(zhì)的一種方法 ,分子量大的先下來. ? 常用的凝膠 : 葡聚糖凝膠 (Sephadex) ? 聚丙烯酰胺凝膠 (BioGEIP) ? 瓊脂糖凝膠（商品名因生產(chǎn)廠家不用） 自由電泳：沒有支持物的一類電泳 紙電泳 區(qū)帶電泳：根據(jù)支持物不同 醋酸纖維膜電泳 瓊脂糖凝膠電泳 PAGE電泳 （ 3）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進行分離 1）電泳 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSPAGE） SDS（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子去污劑，帶有很多負電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合以后，蛋白質(zhì)分子帶有足夠的負電荷，遠遠超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷，蛋白質(zhì)分子原有的電荷就變得無足輕重了，所以在電場上 移動的速度完全取決于蛋白質(zhì)分子的大小 。 1）透析和超濾 超濾法：是最近幾年發(fā)展起來的一種新技術(shù)，利用分子大小不同，來分離蛋白質(zhì)。 （ 4）蛋白質(zhì)的沉淀反應 反應名稱 試 劑 顏色 反應有關(guān)基團 有此反應的蛋白質(zhì)或氨基酸 雙縮脲反應 NaOH、 CuSO2 紫色 或粉紅色 二個以上肽鍵 所有蛋白質(zhì) 米倫反應 HgNO3 、Hg(NO3)2 及HNO3混合物 紅色 Tyr 黃色反應 濃 HNO3及 NH3 黃色 、 橘色 Tyr、 Phe 乙醛酸反應 (HopkingCole 反應 ) 乙醛酸試劑及濃H2SO4 紫色 Trp 坂口反應 (Sakaguchi反應 ) α萘酚 、 NaClO 紅色 胍基 Arg 酚試劑反應
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