生物化學(xué)蛋白質(zhì)(2)-免費(fèi)閱讀
【正文】 ?是用來檢測蛋白質(zhì)制品中有無核酸混存的方法 。 ?如果蛋白質(zhì)制品是純的 ， 直線的斜率為1， 在折點(diǎn)以后 ， 斜率為零 。 但其受還原劑 、 EDTA、 Tritonx100及酚的影響 ， 并且蛋白質(zhì)的種類不同 ， 有較大的變動 。 2．紫外 分光光度計法 ?由于蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸 、 色氨酸在280nm左右具有最大吸收 ， 所以在 280nm吸收值與濃度成正比 ， 可用于蛋白質(zhì)含量測定 ?蛋白質(zhì)濃度 mg/ml=－ A260 ?由于此法非常簡便 ， 條件要求低 ， 因此常作為粗略定量蛋白質(zhì)的方法來使用 。 離子交換樹脂是具有酸性或堿性基團(tuán)的人工合成聚苯乙烯酸等不溶性高分子化合物 。 （ 3）根據(jù)電荷不同的純化方法 ①電泳 ②離子交換層析 ①電泳 電泳是溶液中帶電粒子（離子）在電場中移動的現(xiàn)象。 ②溶液中的鹽離子濃度也會影響蛋白質(zhì)的溶解度。 由于懸浮液中顆粒的沉降速率不僅取決于顆粒本身的性質(zhì)，而且也取決于懸浮顆粒介質(zhì)以及作用在顆粒上的力，因此常采用密度梯度離心法對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。 （ 2）蛋白質(zhì)的抽提 選擇適當(dāng)?shù)木彌_液把蛋白質(zhì)提取出來，即為蛋白質(zhì)的抽提。 （ 4）高效（高壓）液相色譜 高效液相色譜儀由高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)等五大部分組成。 一般需經(jīng)過加樣、吸附、洗滌、洗脫和凝膠再生幾個環(huán)節(jié)。 最后用茚三酮顯色。 五、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 2H2N－ C － NH2 H2N－ C－ N－ C－ NH2＋ NH3↑ 1320C O O H O 尿素 雙縮脲 雙縮脲 CuSO4+NaOH 紫紅色物質(zhì) 第五節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 氨基酸 性質(zhì) 蛋白質(zhì) 性質(zhì) 兩性 性質(zhì) 物理 性質(zhì) 兩性 性質(zhì) 紫外吸收 化學(xué)性質(zhì) 分離純 化測定 鹽析 等電點(diǎn) 凝膠過濾 分子大小 膠體性質(zhì) 沉淀作用 α－ NH2 α－ COOH 共同 R基 顏色反應(yīng) 含量測定 變性復(fù)性 離子交換 電泳 含量測定 第六節(jié) 氨基酸及蛋白質(zhì)的分析和分離 一、氨基酸的分析分離 二、蛋白質(zhì)的分離和純化 三、蛋白質(zhì)的定量檢測 四、蛋白質(zhì)的純度分析 一、氨基酸的分析分離 1．層析法的基本原理 2．常用的氨基酸層析方法 ?類型： 分配層析法 (包括柱層析 、 紙層析和薄層層析 )。 3．蛋白質(zhì)的復(fù)性 復(fù)性 :某些變性蛋白質(zhì)，再除去變性因素后，可以“復(fù)性” 。 蛋白質(zhì)變性作用的 實(shí)質(zhì)是維持蛋白質(zhì)分子高級結(jié)構(gòu)的次級鍵和二硫鍵被破壞 ，引起天然構(gòu)象解體，但維持主鏈的共價鍵－肽鍵并未被打斷，即一級結(jié)構(gòu)保持完好。其優(yōu)點(diǎn)在于：不像鹽析那樣存在有大量鹽類，必須經(jīng)透析除去，而且有機(jī)溶劑很易通過稀釋透析及蒸發(fā)等方法除去。 蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用加強(qiáng)，因而溶解度提高。 一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì) 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一 pH值時，蛋白質(zhì)解離成正離子和負(fù)離子的趨勢相等，為兼性離子，即總凈電荷為零，此時在電場中，蛋白質(zhì)分子既不向陽極移動，也不向陰極移動，這個 pH值稱為 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) ，用 pI來表示。 利用蛋白質(zhì)不能透過半透膜的性質(zhì)發(fā)展了的另一蛋白質(zhì)純化方法 — 超濾。 2．有機(jī)溶劑沉淀法 可與水混合的有機(jī)溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等能破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)而使蛋白質(zhì)沉淀。 5．加熱凝固 將接近于等電點(diǎn)附近的蛋白質(zhì)溶液加熱可使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固而沉下。 ②某些側(cè)鏈基團(tuán)暴露出來 。 氨基酸所沒有的一些顏色反應(yīng)，主要是 雙縮脲反應(yīng) ，是蛋白質(zhì)常用的定量分析方法。 紙層析以濾紙為隋性支持物，濾紙纖維和水有較強(qiáng)的親和力，在一般條件下較難脫去，而濾紙纖維與有機(jī)溶劑的親和力甚弱，所以紙層析的 固定相是被濾紙纖維吸附的結(jié)合水 。 根據(jù)分離的原理不同，薄層層析可以分為 吸附薄層層析和分配薄層層析 兩類。 （ 4）高效（高壓）液相色譜 液相色譜法是以液體為載體，將樣品帶入色譜儀進(jìn)行分析的方法。 （ 1）材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎 選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分離開來，首先獲得蛋
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