【正文】 積比增大，水相納米粒子能夠被較厚的油相膜隔離開，降低了在超聲分散過程中納米粒子粘連的幾率，從PdI和粒徑分布圖看出，油水相體積比增大，粒徑分布更加均勻，粒徑減小。從表跟圖中可以看出，粒子粒徑在油相體積較小時(shí)粒徑隨油相體積增加而增加，當(dāng)油相體積增加到一定量時(shí)，則隨著油相體積的增加而減少。表23 油相體系比對(duì)納米粒子粒徑的影響Table 23 Effect of different oil phase on nanoparticles39。（CSNPs）。（CSNPs）。油相：量取液體石蠟25 mL，加入占其體積3% ( g)的Span80,攪拌均勻后備用。（CSNPs）。油相：量取液體石蠟25 mL，加入占其體積3%( g)的Span80,攪拌均勻后備用。（CSNPs）。油相：量取液體石蠟25 mL，加入占其體積2%，3%，4%，5%，6%的Span80，攪拌均勻后備用。（CSNPs）。油相：分別量取液體石蠟5 mL，10 mL，15 mL，20 mL，25 mL，加入占其體積5%的Span80,攪拌均勻后備用。（CSNPs）。油相：分別選用液體石蠟，甲苯各25 mL，加入占其體積5%( g)的Span80,攪拌均勻后備用。本實(shí)驗(yàn)將選取不同殼聚糖溶液濃度，不同油水比，不同的表面活性劑用量以及不同的交聯(lián)劑用量，不同的油相體系，篩選出制備殼聚糖納米粒子的最佳工藝條件，用以后續(xù)的載藥制備。取500 μL CS溶液緩慢滴加到含有表面活性劑span80的的液體石蠟中，經(jīng)超聲處理后形成穩(wěn)定的W/O型微乳液，然后滴加一定量的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌3 h，離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液（CSNPs）。本論文研究中以TEM觀察殼聚糖納米材料的結(jié)構(gòu)。(2) 透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡（Transmission electron microscope，TEM），型號(hào)TEANAI10型透射電子顯微鏡philips，或高分辨透射電子顯微鏡（High resolution transmission electron microscope，HRTEM)，它是把經(jīng)加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向，從而產(chǎn)生立體角散射。測(cè)試范圍下限可達(dá)到1 nm，可測(cè)懸浮液、乳濁液、微乳液等體系。但是很多研究證明對(duì)于粒徑小于1 μm的顆粒，必須用Mie散射理論求解粒徑分布。激光粒度分析法是根據(jù)激光照射到顆粒后，顆粒能使散射的激光產(chǎn)生衍射或散射的現(xiàn)象來測(cè)試粒度分布的。測(cè)量溫度( 177。玻璃儀器均經(jīng)超聲清洗40分鐘，所有反應(yīng)均在室溫中（25 ℃）進(jìn)行。第二章 空白殼聚糖納米粒子的制備 實(shí)驗(yàn)部分 材料與試劑表21實(shí)驗(yàn)試劑Table 21 Reagents used in experiment試劑名稱規(guī)格產(chǎn)地液體石蠟AR天津市化學(xué)試劑公司Span80CP天津市化學(xué)試劑公司殼聚糖90 % MW=60000上海伯奧生物科技有限公司戊二醛(25%)AR天津市百世化工有限公司甲苯AR天津市百世化工有限公司無(wú)水乙醇AR天津市百世化工有限公司石油醚AR天津市百世化工有限公司冰醋酸AR天津市百世化工有限公司實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水，藥品稱量均使用德國(guó)Sartorius 公司的電子分析天平，誤差為177。本文通過乳化交聯(lián)法制得殼聚糖納米粒子載體負(fù)載硒代胱氨酸，并對(duì)MCF7進(jìn)行體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，殼聚糖能夠增強(qiáng)硒代胱氨酸對(duì)MCF7的細(xì)胞毒性，并在較短的時(shí)間內(nèi)起作用。但是研究表明，SeC不易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的滲透性不強(qiáng)。目前癌癥化學(xué)預(yù)防研究的主要目標(biāo)就是尋找高效低毒，作用機(jī)制明確的化學(xué)預(yù)防藥物。 課題的研究意義與創(chuàng)新點(diǎn) 課題的研究意義惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命的疾病。殼聚糖屬親水性聚合物，可制得不同大小的納米粒子，將疫苗，蛋白質(zhì)，抗生素類藥物制成納米粒子系統(tǒng)給藥，不僅能有效防止藥物在體內(nèi)的快速降解，提高藥物的穩(wěn)定性，而且還能將藥物緩慢釋放并靶向送達(dá)體內(nèi)的作用部位，從而達(dá)到長(zhǎng)效緩釋靶向的目的。(6)提高藥物的穩(wěn)定性隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因重組肽和蛋白質(zhì)藥物不斷涌現(xiàn)，應(yīng)用于臨床的種類也越來越多。Mooren等研究了潑尼松龍磷酸鈉殼聚糖納米粒子通過上皮細(xì)胞膜的情況，結(jié)果表明，殼聚糖納米粒子可以改善上皮細(xì)胞膜對(duì)疏水性藥物通透性。(5)提高疏水性藥物對(duì)細(xì)胞膜的通透性，增強(qiáng)細(xì)胞吸收殼聚糖納米粒子溶脹引起的擴(kuò)散釋藥過程可以增加藥物在吸收部位的濃度梯度，對(duì)藥物的吸收具有協(xié)同促進(jìn)作用。(4)降低藥物的毒副作用，提高療效載有藥物的殼聚糖納米粒子循血液循環(huán)到達(dá)靶區(qū)周圍釋放藥物，使靶區(qū)周圍很快達(dá)到有效的治療藥物濃度，而在機(jī)體其他部位藥物的分布量較小，從而減少了對(duì)機(jī)體正常組織的毒副作用，同時(shí)由于載體殼聚糖本身具有一定的生理活性，且無(wú)毒，與藥物可產(chǎn)生協(xié)同作用增強(qiáng)療效。(3)增加藥物的靶向性殼聚糖本身具有一定的黏膜黏附性，通過控制殼聚糖納米粒子的大小，形狀，選擇適當(dāng)?shù)慕o藥方法，能夠提高殼聚糖納米粒子的靶向效果。Wang等制備了殼聚糖胰島素納米粒子，其包封率高達(dá)70%，胰島素的化學(xué)穩(wěn)定性大于95%，并且胰島素可以長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定釋放。Jaganathan等[37]采用乳化交聯(lián)法制備了載有破傷風(fēng)類毒素的殼聚糖納米粒子，穩(wěn)定劑海藻糖能夠保持抗原蛋白質(zhì)的活性，納米粒子的包封率也從加入海藻糖前的40%提高到90%。Hejazi等采用乳化交聯(lián)法制備了包載四環(huán)素的殼聚糖納米粒子。它的應(yīng)用主要有以下幾方面：(1)作為藥物載體，可包埋多種類型藥物殼聚糖納米粒子由于其良好的生物相容性，生物降解性和低細(xì)胞毒性，被廣泛應(yīng)用于藥物載體方面。常見的殼聚糖納米粒子制備方法還有離子凝膠法，反膠束法，殼聚糖包裹法和殼聚糖納米粒子乙?；ǖ萚33]。目前最常用的方法是將殼聚糖醋酸溶液加入含表面活性劑的液體石蠟中，形成W/O型乳劑，升溫再減壓干燥除去溶劑，分離得到殼聚糖納米粒子。 沉淀法反應(yīng)示意圖(6)其他制備方法制備殼聚糖納米粒子的方法還有很多。另一種操作方法為：在殼聚糖溶液中加入表面活性劑，然后再逐滴加入硫酸鈉溶液，攪拌或超聲30分鐘后，離心分離出產(chǎn)物。制備的方法是將用高壓空氣將殼聚糖溶液吹入堿性溶液如氫氧化鈉，氫氧化鈉甲醇溶液或乙二胺溶液中，沉降形成納米粒子。先將殼聚糖與α氨基NCA（Ncarboxyanhydride）接枝共聚，再將一定量L亮氨酸NCA分散至乙酸乙酯中，并用Span80乳化后與水溶性殼聚糖在一定條件下反應(yīng)2 h，經(jīng)進(jìn)一步處理可得殼聚糖空心納米粒子[32]。 逐層自組裝反應(yīng)流程(4)界面聚合法界面聚合法是將含有親水性單體溶液（多元胺，多元酚，多元醇等）乳化分散在疏水性的有機(jī)溶劑中，然后加入溶于該有機(jī)溶劑的疏水性單體（多元酰氯，多元硫酰氯，多異氰酸酯等），使兩種單體在水/油界面處發(fā)生縮聚反應(yīng)形成聚合物球殼。通過限制溶質(zhì)沉降次數(shù)可控制空心納米粒子的球殼厚度，除去納米粒子中的核物質(zhì)即可獲得所需的空心結(jié)構(gòu)。 噴霧干燥法操作流程(3)逐層自組裝逐層自組裝法適用于制備球壁厚度可控的空心納米粒子。納米粒子的粒徑取決于噴嘴的直徑，噴嘴流率，霧化壓力，入口溫度和交聯(lián)程度等因素[32]。(2)噴霧干燥法噴霧干燥法是以熱氣流干燥霧化液滴為基礎(chǔ)的。沈宏亮等[34]利用乳化交聯(lián)法制備了左氧氟沙星羧甲基殼聚糖納米粒子，并對(duì)殼聚糖納米粒子的體外釋藥性能進(jìn)行了深入的研究。它是利用殼聚糖的活性氨基基團(tuán)與醛類的醛基交聯(lián)，得到一種Schiff堿。制備殼聚糖納米粒子的方法有多種[32]，其選擇的依據(jù)受以下因素影響：①目標(biāo)粒徑分布；②有效成分的熱化學(xué)性質(zhì)與穩(wěn)定性；③有效成分的釋藥動(dòng)力學(xué)與重現(xiàn)性；④載藥納米粒子的穩(wěn)定性與毒性溶劑殘留。它能保護(hù)包埋物免受外界環(huán)境影響，以及屏蔽味道，顏色或氣味，降低揮發(fā)性和毒性，控制可持續(xù)釋放，增加藥效等。 殼聚糖納米粒子的制備殼聚糖緩釋體系主要分為：殼聚糖納米粒子，殼聚糖微球，殼聚糖緩釋片，殼聚糖緩釋膜，殼聚糖緩釋凝膠5種類型[26]。殼聚糖不與體內(nèi)組織產(chǎn)生異物反應(yīng)，在體內(nèi)被溶菌酶降解為對(duì)人體無(wú)毒的N乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖[29]。由于氨基的存在，它是自然界中唯一帶正電荷的堿性多糖。殼聚糖的化學(xué)名稱為 (14)2氨基2脫氧D葡聚糖，甲殼素的化學(xué)名稱為(14)2乙酰胺基2脫氧D葡聚糖[27]。 殼聚糖納米粒子在納米藥物載體領(lǐng)域的制備和應(yīng)用 殼聚糖的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)殼聚糖也稱為甲殼胺或幾丁聚糖殼聚糖，是一種天然的生物高分子線性多氨基多糖，為甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物。蛋白質(zhì)一般包括如明膠，白蛋白，絲蛋白等物質(zhì)，多糖類一般包括如殼聚糖，海藻酸鈉，環(huán)糊精，果膠等物質(zhì)。近年來，生物大分子材料由于其可再生性，無(wú)毒性以及良好的生物相容性，生物可降解性和黏膜粘附性等優(yōu)點(diǎn)成為藥物載體研究的熱點(diǎn)，于是利用生物大分子材料來制備納米藥物載體的研究應(yīng)運(yùn)而生。天然高分子聚合物主要包括天然多糖，多肽以及其他親水性生物可降解聚合物[23]。 納米藥物載體的類型目前，用于納米藥物載體研究的生物可降解聚合物主要有合成聚合物和天然高分子聚合物。雖然，納米藥物載體作為載藥系統(tǒng)有諸多優(yōu)點(diǎn)，但仍存在一些問題，如生物相容性以及細(xì)胞毒性等。 納米藥物載體的研究進(jìn)展理想的納米粒載體應(yīng)是無(wú)毒和可生物 的。納米技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用主要表現(xiàn)在一下幾個(gè)方面：控釋載藥微粒，靶向載藥微粒，磁導(dǎo)航靶向載藥微粒，基因載體[20]。納米技術(shù)與材料已經(jīng)在航天，汽車，消費(fèi)日用品，生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得應(yīng)用，并取得一些列舉世矚目的成果[19]。當(dāng)物體達(dá)到納米級(jí)后，納米粒子在熱學(xué)、光學(xué)、磁學(xué)力學(xué)及電化學(xué)方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[18]。 nm內(nèi)的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)的構(gòu)造技術(shù)，即納米級(jí)材料的設(shè)計(jì)，制造，測(cè)量和控制技術(shù)[17]。1990年7月，在美國(guó)巴爾的摩召開了第一界國(guó)際納米科技會(huì)議，標(biāo)志著納米科技的正式誕生。因此，希望借助納米藥物載體來提高細(xì)胞吸收，減少它進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的時(shí)間。雖然SeC作為抗腫瘤藥物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，但是從Chen等[16]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SeC的水溶性與穩(wěn)定性較差，進(jìn)入MCF7細(xì)胞發(fā)揮作用的時(shí)間比較長(zhǎng)，36 h之后才觀察到明顯的細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，且72 h后的IC50=177。因此，SeC具有更廣譜高效的抗腫瘤活性，且對(duì)正常細(xì)胞的毒性較小。Chen等[15]通過實(shí)驗(yàn)比較幾種含硒化合物對(duì)八種人類癌癥細(xì)胞的抗癌活性，實(shí)驗(yàn)證明，SeC與亞硒酸鹽對(duì)A375，MCF7，HepG2，SW620等癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性比硒代蛋氨酸，硒甲基硒氨酸，硒酸鹽等強(qiáng)。硒代胱氨酸是胱氨酸分子中S被Se所取代后的含硒氨基酸[14]。 硒代胱氨酸的研究現(xiàn)狀 硒代胱氨酸的性質(zhì)硒代氨基酸在有機(jī)硒化合物中，有特殊的重要性。其中含硒氨基酸硒代半胱氨酸（selenocysteine）是生物合成和摻入到蛋白質(zhì)分子中的第21種氨基酸[12]。無(wú)機(jī)硒具有較好的抗癌活性，但無(wú)機(jī)硒化合物脂溶性差，不易進(jìn)入細(xì)胞，且具有蓄積毒性和致突變作用，限制了它在臨床上的應(yīng)用。有機(jī)硒主要包括硒多糖，含硒蛋白質(zhì)，烷基硒，甲基硒酸以及人工合成的具有生物活性的有機(jī)硒化合物。根據(jù)硒在自然界的存在形態(tài)，硒化合物可分為無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒化合物[10]。 硒具有抗氧化作用，它是谷胱甘肽過氧化酶（GSHPx）的活性中心，常以硒代半胱氨酸形式存在，GSHPx能減輕或阻斷自由基所致的脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，保護(hù)蛋白質(zhì)、清除自由基和DNA及生物膜的完整性，修復(fù)損傷分子部位；同時(shí)能提高機(jī)體免疫能力，抵抗疾病[9]。硒可以保護(hù)心臟、肝臟等免受損傷，對(duì)癌癥、心血管疾病、艾滋病等起到治療和控制作用[57]。1988年，我國(guó)已經(jīng)把硒列為膳食營(yíng)養(yǎng)素之一。1975年Awasthi等人首次明確指出，硒是人體必需的微量元素[4]。1957年美國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)家Schwarz和Foltz首次用硒治療動(dòng)物肝壞死取得成功后，硒逐漸明確為動(dòng)物體內(nèi)必需的微量元素[2] 。1817年，硒由瑞典學(xué)者Berzelius發(fā)現(xiàn)，并命名為Selenium。 Selenocystine。關(guān)鍵詞：殼聚糖納米粒子；乳化交聯(lián)法；硒代胱氨酸；體外抗腫瘤活性Preparation and in vitro anticancer activity of Selenocystineloaded chitosan nanoparticlesAbstractSelenocystine (SeC), a naturally occurring selenoamino acid, has been shown to be a novel pound with broadspectrum anticancer activity. However, it takes a long time for SeC to interact with cancer cells due to its poor solubility and stability. Polymer, a new drug carrier, is widely used in pharmaceutical field. The encapsulation of drug helps to improve drug stability as well as anticancer activity. Chitosan is a popular drug carrier due to its biopatible, biodegradable and nontoxic properties. In this paper, Chitosan loaded SeC nanopa