【正文】 使其溶解后備用。散射角的大小與樣品的密度、厚度相關(guān)，因此可以形成明暗不同的影像。本論文中，利用納米粒度儀來(lái)快速、準(zhǔn)確方便地對(duì)納米溶膠樣品中顆粒的大小及分布、形態(tài)等進(jìn)行測(cè)定。散射式納米粒度分析儀基于動(dòng)態(tài)光散射 （ DLS） 技術(shù)，與激光散射儀中動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量粒徑分布的原理一樣，是借助光子相關(guān)原理 （ PCS)檢測(cè)因布朗運(yùn)動(dòng)及 多普勒效應(yīng)產(chǎn)生的散射光的微小頻移而得到散射質(zhì)點(diǎn)動(dòng)態(tài)行為的信息技術(shù)。其依據(jù)的光學(xué)原理為 Fraunhofer 衍射和 Mie 散射理論，因此相應(yīng)的激光粒度分析儀分為激光衍射式和激光動(dòng)態(tài)散射式兩類(lèi)。 ) ℃ ； 常用的納米粒度儀均采用激光作光源，故納米粒度儀也稱(chēng)激光納米粒度儀或激光粒度儀。 實(shí)驗(yàn)儀器 表 22 實(shí)驗(yàn)儀器 Table 22 Apparatus used in experiment 儀器名稱(chēng) 型號(hào) 產(chǎn)地 電子天平 BP301S 德國(guó) Sartorius 公司 離心機(jī) Centrifuge 5804R Eppendorf 超聲破碎儀 JY92IIDN 寧波新芝生物科技股份有限公司 納米粒度儀 NanoZS 英國(guó)馬爾文 (Malvern)公司 透射電子顯微鏡 TECNAI10 荷蘭 Philips 相關(guān)儀器原理 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 13 （ 1） NanoZS 型納米粒度儀 英國(guó)馬爾文公司 (Malvern) NanoZS 型納米粒度儀，入射光為氦氖激光，波長(zhǎng) λ = 633 nm，入射角 90176。 mg。 創(chuàng)新點(diǎn) 通過(guò)以 CSNPs 為載體，有效增強(qiáng) SeC 的體外抗腫瘤活性，并顯著縮短 SeC 對(duì) MCF7起作用的時(shí)間。因此，希望借助納米藥物載體來(lái)提高細(xì)胞吸收，減少它進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的時(shí)間。硒代胱氨酸是一種新型高效的抗腫瘤藥物，生物活性高，對(duì)正常細(xì)胞毒性小。癌癥的化學(xué)預(yù)防是利用天然的或合成的化合物干預(yù)癌前病變，預(yù)防腫瘤的發(fā)生或使腫瘤細(xì)胞分化逆轉(zhuǎn)，從而達(dá)到預(yù)防惡性腫瘤的目的。 Alexakis 等制備了小牛胸腺 DNA海藻酸酯 納米粒子 ，外面包覆殼聚糖制成載藥 納米粒子 后經(jīng)過(guò)胃腸道時(shí)藥物不被破壞， 60%DNA可以從糞便等排泄物中得到。與化學(xué)合成藥物相比，肽類(lèi)藥物具有毒副作用輕，吸收快的特點(diǎn)，但由于此類(lèi)藥物分子質(zhì)量大，在體內(nèi)外的穩(wěn)定性差，在胃腸道內(nèi)容易被酶降解，半衰期短，生物利用度極低，臨床應(yīng)用受限制。 Mitra 等將 Doxorubicin（ DXR）包封于殼聚糖殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 11 納米粒子 中，不僅腫瘤實(shí)體內(nèi)藥物濃度提高，作用維持時(shí)間延長(zhǎng)，治療效果改善，不良反應(yīng)也明顯減輕。同時(shí)殼聚糖分子可以改變膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，打開(kāi)細(xì)胞通道，有利于提高藥物在細(xì)胞間瞬間滲透的能力，促進(jìn)藥物在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥效。徐海濤等觀察了殼聚糖 順鉑緩釋 納米粒子 對(duì) C6膠質(zhì)瘤大鼠瘤內(nèi)化療的療效，結(jié)果表明，殼聚糖 順鉑 納米粒子 毒性小，安全性較高，療效可靠。李揚(yáng)等利用乳化分散法制備了左氧氟沙星羧甲基殼聚糖 納米粒子 ，體內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果表明所載藥物可如預(yù)想設(shè)計(jì)到達(dá)結(jié)腸定位釋放。 Chandy 等 [37]制備了殼聚糖包衣的 PLA/PLGA 納米粒子 ，用于 5氟尿嘧啶的腦膠質(zhì)瘤的靶向治療，研究發(fā)現(xiàn)所得 納米粒子 表面孔空隙率低，藥物初次突釋后呈典型的二相釋藥，可靶向結(jié)合腦膠質(zhì)瘤，且穩(wěn)定釋放 30 d 以上。 (2)緩控釋給藥 殼聚糖分子內(nèi)具有活性基團(tuán)氨基，可與含雙官能團(tuán)的醛類(lèi)或酸酐類(lèi)藥物發(fā)生化學(xué)交聯(lián)，使藥物大量分布于交聯(lián)結(jié)構(gòu)，緩慢釋放，包封在殼聚糖 納米粒子 內(nèi)的藥物具有明顯的緩釋?zhuān)蒯屘攸c(diǎn)。經(jīng)沙鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性增加，能夠黏附在胃黏膜上。所包埋的常見(jiàn)藥物有：牛血清白蛋白（ BSA），青霉素，四環(huán)素，維生殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 10 素，胰島素等。 殼聚糖 納米粒子 的應(yīng)用 殼聚糖 納米粒子 在腫瘤治療方面應(yīng)用廣泛 [33] 。 Sinha 等 [28]采用此法制備了性質(zhì)優(yōu)良的殼聚糖 納米粒子 。溶劑蒸發(fā)法又稱(chēng)液中干燥法，常用的溶劑蒸發(fā)法是根據(jù)聚合物與藥物的性質(zhì)制成乳液體系，形成穩(wěn)定乳液后，采用升溫，減壓抽提或連續(xù)攪拌等方法使有機(jī)溶劑擴(kuò)散進(jìn)入連續(xù)相并通過(guò)連續(xù)相和空氣的界面蒸發(fā)， 納米粒子 固化，并經(jīng)過(guò)處理最終得到載藥 納米粒子 的過(guò)程 [32]。此法制備的殼聚糖 納米粒子 酸穩(wěn)定性較強(qiáng) [31]。然后用冷熱水交替洗滌提純產(chǎn)物。 圖 界面聚合法反應(yīng)流程 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 9 (5)沉淀法 沉淀法是利用殼聚糖不溶于堿性溶液的性質(zhì)制備 納米粒子 。 Wang 等在溫和的條件下通過(guò)界面聚合法一步制備多糖 多肽復(fù)合空心 納米粒子 。 Shao 等 [36]等將聚苯乙烯磺酸鈉 /殼聚糖聚電解質(zhì)溶液吸附于制備好的殼聚糖 納米粒子 模板表面，經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié) pH 值，層層沉積后，進(jìn)一步處理即可得到所需的殼聚糖 納米粒子 ，如圖 所示 [32]。 納米粒子 的球殼是通過(guò)溶質(zhì)逐層沉降制得的。 He 等 [35]將配置好的殼聚糖水溶液與一定比例的戊二醛水溶液混合均勻，然后進(jìn)行噴霧干燥，制備出的殼聚糖 納米粒子 粒徑在 312 μm之間。此法是將殼聚糖溶于酸性溶液中，再將藥物溶解或分散于該殼聚糖溶液，加入一定量的交聯(lián)劑，在惰性的熱氣流中噴霧干燥，當(dāng)液體通過(guò)蠕動(dòng)泵輸送到噴嘴后，壓縮空氣將液體霧化為小液滴，液滴與熱空氣被共同吹入一個(gè)腔體中，液滴中的酸迅速蒸發(fā)，從而形成殼聚糖含藥納米粒子 [33]。 (2)噴霧干燥法 噴霧干燥法是以熱氣流干燥霧化液滴為基礎(chǔ)的。沈宏亮等 [34]利用乳化交聯(lián)法制備了左氧氟沙星羧甲基殼聚糖 納米粒子 ，并對(duì)殼聚糖 納米粒子 的體外釋藥性能進(jìn)行了深入的研究。此法是將殼聚糖溶液加入含有表面活性劑的油相中形成 W/O 型乳劑，再加入一定量的交聯(lián)劑如戊二醛，甲醛，三聚磷酸鹽，檸檬酸鹽，硫酸鹽和京尼平等進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)固化，通過(guò)離心純化即可制得殼聚糖 納米粒子 [33]。它是利用殼聚糖的活性氨基基團(tuán)與醛類(lèi)的醛基交聯(lián)，得到一種 Schiff 堿。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 6 制備殼聚糖 納米粒子 的方法有多種 [32]，其選擇的依據(jù)受以下因素影響： ① 目標(biāo)粒徑分布； ② 有效成分的熱化學(xué)性質(zhì)與 穩(wěn)定性； ③ 有效成分的釋藥動(dòng)力學(xué)與重現(xiàn)性； ④ 載藥納米粒子 的穩(wěn)定性與毒性溶劑殘留。它能保護(hù)包埋物免受外界環(huán)境影響，以及屏蔽味道，顏色或氣味，降低揮發(fā)性和毒性，控制可持續(xù)釋放，增加藥效等。 殼聚糖 納米粒子 的制備 殼聚糖緩釋體系主要分為：殼聚糖納米粒子，殼聚糖 微球 ，殼聚糖緩釋片，殼聚糖緩釋膜，殼聚糖緩釋凝膠 5 種類(lèi)型 [26]。殼聚糖不與體內(nèi)組織產(chǎn)生異物反應(yīng)，在體內(nèi)被溶菌酶降解為對(duì)人體無(wú)毒的 N乙 酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖 [29]。由于氨基的存在，它是自然界中唯一帶正電荷的堿性多糖。結(jié)構(gòu)式如圖 所示。在自然界中，殼聚糖廣泛存在于低等植物菌類(lèi)，藻類(lèi)的細(xì)胞，節(jié)肢動(dòng)物蝦，蟹，蠅蛆和昆蟲(chóng)的外殼，貝類(lèi)，軟體動(dòng)物（如魷魚(yú)，烏賊）的外殼殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 5 和軟骨，高等植物的細(xì)胞壁等，每年生物合成的資源量高大 100 億 t，是地球上僅次于植物纖維的第二大生物資源 [26]。由于生物大分子可以從自然界的動(dòng)植物中獲得，生物相容性良好，并且可被生物體內(nèi)的酶降解，毒副作用較小，且分子上帶有的羥基，氨基，羧基等大量可反應(yīng)的官能團(tuán)，可作為化學(xué)修飾的位點(diǎn)，因此它們作為藥物載體材料具有廣闊的應(yīng)用前景 [25]。用于納米藥物載體的生物大分子主要包含蛋白質(zhì)和多糖兩大類(lèi)。但是，通過(guò)化學(xué)方法合成得到的大部分藥物載體在生物相容性，可降解性以及細(xì)胞毒性等方面還存在不盡如意的地方 [24]。合成聚合物主要有聚乳酸（ PLA）、聚乙醇酸（ PGA）、聚乳酸共聚乙醇酸（ PLGA）、聚已內(nèi)酯（ PCL）、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐等。因此，尋找生物相容性好，低毒性的納米藥 物載體成為了近年來(lái)研究的目標(biāo)。一種理想的納米藥物載體應(yīng)具備以下特征 [21] ： ①具有較高的載藥量 ②具有較高的包封率 ③制備和純化方法簡(jiǎn)便，容易放大到工業(yè)化生產(chǎn) ④載體材料可生物降解，毒性較低或沒(méi)有毒性 ⑤具有適當(dāng)?shù)牧脚c粒型 ⑥具有較長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間 納米藥物載體的種類(lèi)有以下幾種（如圖 所示）：①納米聚合物藥物載體 ，包括：聚合物納米粒（納米囊和納米球）納米樹(shù)突狀聚合物和聚合物膠束②納米脂質(zhì)體藥物載體，③納米病毒藥物載體，④碳納米管 [22]。其中，納米藥物載體在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中控釋緩釋的應(yīng)用極為廣泛，提高藥物的利用率療效和減少藥物的副作用已成為醫(yī)藥研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要課題。隨著納米技術(shù)向醫(yī)學(xué)界不斷滲透，納米技術(shù)在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用，特別在腫瘤的診斷和治療方面，受到了廣泛的關(guān)注 [17]。進(jìn)入 21 世紀(jì)，納米技術(shù)迅速發(fā)展，作為一個(gè)多學(xué)科交叉領(lǐng)域，涉及面廣應(yīng)用十分廣泛。納米材料具有小尺寸效應(yīng)、量子尺寸 效應(yīng)，表面效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)四大效應(yīng)。納米，是尺寸度量單位， 1 納米 =109 米，相當(dāng)于 4 個(gè)原子并列的直徑。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 3 納米藥物載體在腫瘤治療中的應(yīng)用 納米技術(shù)的研究進(jìn)展 早在 1959 年，著名物理諾貝爾獎(jiǎng)獲得者 Feynman 就預(yù)言了納米科技的出現(xiàn)及前景。 μΜ，說(shuō)明 SeC 不易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞， 對(duì)細(xì)胞的滲透性不強(qiáng)。因此， SeC 是一種新型高效的抗腫瘤藥物。且 SeC 對(duì)人類(lèi)正常纖維原細(xì)胞 Hs68 的細(xì)胞毒性很小， IC50400 μΜ，毒性遠(yuǎn)小于亞硒酸鹽。 圖 硒代胱氨酸的結(jié)構(gòu)式 硒代胱氨酸的抗癌作用 SeC，是一種天然存在的含硒氨基酸，在化學(xué)預(yù)防與治療方面具有巨大的潛力。硒代胱氨酸 是胱氨酸分子中 S 被 Se 所取代后的含硒氨基酸 [14]。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 2 硒代胱氨酸的研究現(xiàn)狀 硒代胱氨酸的性質(zhì) 硒代氨基酸在有機(jī)硒化合物中，有特殊的重要性。其中含硒氨基酸 硒代半胱氨酸（ selenocysteine）是生物合成和摻入到蛋白質(zhì)分子中的第 21 種氨基酸[12]。無(wú)機(jī)硒具有較好的抗癌活性，但無(wú)機(jī)硒化合物脂溶性差，不易進(jìn)入細(xì)胞，且具有蓄積毒性和致突變作用，限制了它在臨床上的應(yīng)用。有機(jī)硒主要包括硒多糖，含硒蛋白質(zhì)，烷基硒，甲基硒酸以及人工合成的具有生物活性的有機(jī)硒化合物。根據(jù)硒在自然界的存在形態(tài)，硒化合物可分為無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒化合物 [10]。 硒具有抗氧化作用，它是谷胱甘肽過(guò)氧化酶（ GSHPx）的活性中心，常以硒代半胱氨酸形式存在， GSHPx 能減輕或阻斷自由基所致的脂質(zhì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng)，保護(hù)蛋白質(zhì)、清除自由基和 DNA 及生物膜的完整性，修復(fù)損傷分子部位；同時(shí)能提高機(jī)體免疫能力，抵抗疾病 [9]。硒 可以保護(hù)心臟、肝臟等免受損傷，對(duì)癌癥、心血管疾病、艾滋病等起到治療和控制作用 [57]。 1988 年，我國(guó)已經(jīng)把硒列為膳食營(yíng)養(yǎng)素之一。 1975 年Awasthi 等人首次明確指出，硒是人體必需的微量元素 [4]。 1957 年美國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)家 Schwarz 和 Foltz 首次用硒治療動(dòng)物肝壞死取得成功后，硒逐漸明確為動(dòng)物體內(nèi)必需的微量元素 [2] 。 1817 年，硒由瑞典學(xué)者 Berzelius 發(fā)現(xiàn)，并命名為 Selenium。 Selenocystine。 關(guān)鍵詞 ：殼聚糖 納米粒子 ；乳化交聯(lián)法；硒代胱氨酸； 體外抗腫瘤活性 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其體外抗腫瘤活性的研究 暨南大學(xué)本科生畢業(yè)論文 II Preparation and in vitro anticancer activity of Selenocystineloaded chitosan nanoparticles Abstract Selenocystine (SeC), a naturally occurring selenoamino acid, has been shown to be a novel pound with broadspectrum anticancer activity. However, it takes a long time for SeC to interact with cancer cells due to its poor solubility and stability. Polymer, a new drug carrier, is widely used in pharmaceutical field. The encapsulation of drug helps to improve drug stability as well as anticancer activity. Chitosan is a popular drug carrier due to its biopatible, biodegradable and nontoxic properties. In this paper, Chitosan loaded SeC nanoparticles were prepared in emulsion by using gluta