【導(dǎo)讀】腫瘤藥物在腫瘤化學預(yù)防與治療中發(fā)揮著重要的作用。然而，SeC進入腫瘤細胞與其作用。需要較長一段時間，細胞滲透性較差。高分子載藥納米粒子是近年來發(fā)展起來的新劑。殼聚糖是一種優(yōu)良的天然藥物載體，具有良好的生物相容性，生物可降解性和無。毒性,被廣泛地用作醫(yī)藥載體。本文以殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，液體石蠟為乳化。體系，制備出粒徑小，分散性好，載藥率及包封率較高的SeC殼聚糖納米粒子。的抑制作用，并增強其體外抗腫瘤活性。

　　

【正文】 表面能，減少 納米粒子 粘連的幾率。乳化劑的用量需要適中，太少 (2%)可能導(dǎo)致界面層太薄，膜強度不夠。隨著乳化劑用量的增加，界面膜厚度和強度逐漸增加，過量會導(dǎo)致膜層太厚，不容易交聯(lián)，后續(xù)的洗滌也變得困難。結(jié)果表明，控制 span80 的用量為油相體積的 3%可以取得粒徑較小的產(chǎn)物。 表 25 Span80 用量對 納米粒子 的影響 Table 25Effect of Span80 dosage on nanoparticles39。 sizes No. Percentage Span80(g) Size() PdI B1 2% B2 3% B3 4% B4 5% B5 6% 2% 3% 4% 5%04080120160200240280320360 Size() 圖 不同 Span80 對 納米粒子 影響對比圖 Fig. Comparison of different Span80 dosage on nanoparticles39。 sizes 殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 21 B 1B 2B 3B 4B 5 圖 不同 Span80 用量 納米粒子 的粒徑分布 Fig. Comparison of different Span80 dosage on nanoparticles39。 sizes (B1) 2% (B2) 3% (B3) 4% (B4) 5% (B5) 6% (2)TEM 分析 TEM 觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品后用磷鎢酸進行染色，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。結(jié)果與納米粒度儀測殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 22 得的平均粒徑大約相符。從 TEM 圖中可觀察到，當表面活性劑用量較少或較多時，形成的 納米粒子 性狀不規(guī)則，并且粒徑較大。這可能是由于乳化劑過少或過多造成乳滴界面膜不穩(wěn)定，表面不均勻，存在凹陷，造成在 TEM 成像時的襯度太低，以致觀察不到物像，故需要磷鎢酸染色。當乳化劑用量適中，形成的乳滴分散均勻，交聯(lián)固化后形成的納米粒子 粒徑較小，且分布均勻， TEM 成像時襯度足夠，故磷鎢酸染 色后，仍呈黑色圓球。 綜上， span80 用量為油相體積的 3%時，殼聚糖納米粒子的粒徑最小，形貌較好，且分布均勻。 圖 不同 Span80 用量納米粒子的 TEM 圖 Fig. TEM images of nanoparticles39。 shapes of different Span80 dosage (B1) 2% (B2) 3% (B4) 5% 殼聚糖濃度對殼聚糖 納米粒子 的影響 (1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析 表 26 與圖 是不同殼聚糖濃度對殼聚糖納米粒子粒徑的影響。由表 24 與圖 28可見，當殼聚糖溶液濃度為 10 mg/ml 時，產(chǎn)物的粒徑達到了微米級。這可能是由于殼聚糖溶液濃度過低，水相液滴中所含的殼聚糖量極少，乳化分散后與交聯(lián)劑交聯(lián)得到的粒子結(jié)構(gòu)松散，不致密，因此粒徑較大。當殼聚糖濃度為 15 mg/mL 時，產(chǎn)物的粒徑最小，分布性最好。隨著殼聚糖溶液濃度的增加，產(chǎn)物的粒徑也增加，分散性變差，且顏色加深，由白色逐漸變成棕黃色。這可能是由于殼聚糖濃度增加，粘度也隨著增加，殼聚糖間互相粘連使得乳化時分子較大，最終造成交聯(lián)得到的粒子 粒徑也變大。 殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 23 表 26 殼聚糖濃度對納米粒子粒徑的影響 Table 26Effect of CS concentration on nanoparticles39。 sizes No. CS(mg/ml) size() PdI C1 10 C2 15 C3 20 C4 25 15 20 2504080120160200240280320 Size(m)m g/ m l 圖 殼聚糖濃度對 納米粒子粒徑的影響 Fig. Comparison of different CS concentration on nanoparticles39。 sizes 殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 24 C 1C 2C 3C 4 圖 不同殼聚糖濃度的 納米粒子 粒徑分布圖 Fig. Comparison of different CS concentration on nanoparticles39。 sizes (C1) 10 mg/mL (C2) 15 mg/mL (C3) 20 mg/mL (C4) 25 mg/mL (2) TEM 分析 TEM 觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品后用磷鎢酸進行染色，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。結(jié)果與納米粒度儀測得的平均粒徑大約相符。從 TEM 圖中可觀察到，殼聚糖溶液濃度過小或過大，得到的產(chǎn)物粒徑均比較大。殼聚糖濃度較小，形成的納米粒子結(jié)構(gòu)松散。殼聚糖濃度較大， 納米粒子 間粘連現(xiàn)象嚴重，造成產(chǎn)物粒徑大。因此，通過 TEM 圖表明，當殼聚糖溶液濃度為15 mg/mL時，制備得到的殼聚糖納米粒子粒徑小，形貌好，且分布均勻。 殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 25 圖 不同殼聚糖濃度 納米粒子 TEM 圖 Fig. TEM images of nanoparticles39。 shapes of different CS concentration (C1) 10 mg/mL (C2) 15 mg/mL (C3) 20 mg/mL 交聯(lián)劑用量對殼聚糖 納米粒子 的影響 (1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析 從表 27 與圖 可以看出當交聯(lián)劑的質(zhì)量分數(shù)不變時，改變交聯(lián)劑的體積對殼聚糖納米粒子的影響不呈規(guī)律性分布。這可能是由于選擇的交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù)適中，在體積較小時已經(jīng)能夠與殼聚糖交聯(lián)固化，當體積增加時，多余的交聯(lián)劑不參加交聯(lián)。也可能是由于隨著交聯(lián)劑體積的增加，交聯(lián)得到的殼聚糖 納米粒子 結(jié)構(gòu)松散，粒徑分布不均勻，在洗滌過程中，大的粒子聚集沉淀被洗去，剩下粒徑比較小的殼聚糖納米粒子，因此殼聚糖納米粒子的粒徑與交聯(lián)劑的體積無關(guān)。 ①同交聯(lián)劑體積 表 27 交聯(lián)劑 (1 %)體積對 納米粒子 粒徑的影響 Table 27Effect of G dosage on nanoparticles39。 sizes No. Glutaraldehyde aq(1%)/ml Size() PdI D1 2 D2 3 D3 4 D4 5 D5 6 殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 26 2 3 4 5 604080120160200240280 Size(m)V / m l 圖 不同交聯(lián)劑體積對 納米粒子 粒徑 的 影響 Fig. Comparison of different glutaraldehyde volume on nanoparticles39。 sizes ②不同交聯(lián)劑濃度 表 28 與圖 表明，殼聚糖納米粒子的粒徑與交聯(lián)劑的濃度有關(guān)。戊二醛結(jié)構(gòu)中存在著兩個活潑的醛基，有很高的反應(yīng)活性，易與殼聚糖分子中的自由氨基反應(yīng)，形成交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當交聯(lián)劑濃度較低時，交聯(lián)程度小，交聯(lián)效果差。隨著交聯(lián)劑濃度的增加，交聯(lián)程度增大，交聯(lián)結(jié)構(gòu)緊密。但濃度太大，導(dǎo)致局部濃度過大而使得局部液滴間也進行交聯(lián)，造成粒徑分布不均勻，且粒徑增加。 表 28 交聯(lián)劑濃度對納米粒子粒徑的影響 Table 28Effect of G’s concentration on nanoparticles39。 sizes No. Glutaraldehyde aq Size() PdI E1 % E2 1% E3 3% E4 5% E5 7% 殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 27 % 1% 3% 5% 7%04080120160200240280320 Size()V / m l 圖 不同交聯(lián)劑濃度對 納米粒子 粒徑 的 影響 Fig. Comparison of different glutaraldehyde concentration on nanoparticles39。 sizes E 1E 2E 3E 4E 5 圖 不同交聯(lián)劑濃度 納米粒子 粒徑分布圖 Fig. Comparison of different glutaraldehyde concentration on nanoparticles39。 sizes (E1) % (E2) 1% (E3) 3% (E4) 5% (E5) 7% 殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 28 (2)TEM 分析 TEM 觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。結(jié)果與納米粒度儀測得的平均粒徑大約相符。從 TEM 圖中可觀察到，當交聯(lián)劑濃度較低時，一開始局部進行的是液滴內(nèi)交聯(lián)，隨后隨著交聯(lián)劑體積增加，進行液滴間交聯(lián)，因此交聯(lián)得到的產(chǎn)物粒子分布不均勻，交聯(lián)效果差。隨著交聯(lián)劑濃度的增加，交聯(lián)程度增大，交聯(lián)結(jié)構(gòu)緊密。但濃度太大，導(dǎo)致局部濃度過大而使得局部液滴間也進行交聯(lián)，造成粒徑分布不均勻，且粒徑增加。綜上，選擇 3 %的戊二醛溶液交聯(lián)時得到的產(chǎn)物粒徑較小，形貌好，且分布均勻。 圖 不同交聯(lián)劑濃度 納米粒子 TEM 圖 Fig. TEM image of nanoparticles39。 shapes of different glutaraldehyde concentration (E1) % (E3) 3% (E5) 7% 本章小結(jié) 通過以上實驗，表明乳液交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒子受到幾個因素的影響 ——不同油相體系，油水相比例，表面活性劑用量，殼聚糖濃度以及交聯(lián)劑用量。通過各種表征方法分析各因素對殼聚糖 納米粒子 形成的粒徑與形貌的影響。由粒徑分布圖看出，殼聚糖 納米粒子 粒徑與油水相比成反比，與表面活性劑用量成正比，與殼聚糖濃度與成正比，與交聯(lián)劑濃度成正比，與油相體系的粘度成反比。 通過以上實驗， 最終確定制備載藥殼聚糖納米粒子的最佳條件為：殼聚糖濃度為 15 mg/mL, 油水比為 50:1， 表面活性劑為油相體積的 3%，交聯(lián)劑濃度為 3%。 殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 29 第三章 殼聚糖納米粒子負載硒代胱氨酸的制備 實驗部分 實驗材料 表 31 實驗試劑 Table31 Reagents used in experiment 試劑名稱 規(guī)格 產(chǎn)地 液體石蠟 AR 天津市化學試劑公司 Span80 CP 天津市化學試劑公司 殼聚糖 90 % MW=60000 上海伯奧生物科技有限公司 硒代胱氨酸 AR Sigma 公司 戊二醛 (25%) AR 天津市百世化工有限公司 無水乙醇 AR 天津市百世化工有限公司 石油醚 AR 天津市百世化工有限公司 冰醋酸 AR 天津市百世化工有限公司 實驗用水均為二次蒸餾水，藥品稱量均使用德國 Sartorius 公司的電子分析天平，誤差為 177。 mg。玻璃儀器均經(jīng)超聲清洗 40 分鐘，所有反應(yīng)均在室溫中 （ 25 ℃ ） 進行。 實驗儀器 表 32 實驗儀器 Table 32 Apparatus used in experiment 儀器名稱 型號 產(chǎn)地 電子天平 BP301S 德國 Sartorius 公司 離心機 Centrifuge 5804R Eppendorf 超聲破碎儀 JY92IIDN 寧波新芝生物科技股份有限公司 電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 Optima20xxDV 美國 PerkinElmer 公司 納米粒度儀 NanoZS 英國馬爾文 (Malvern)公司 透射電子顯微鏡 TECNAI10 荷蘭 Philips 殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 30 實驗方法 由第二章空白殼聚糖納米粒子的制備條件優(yōu)化得出制備殼聚糖粒子的最佳條件，即殼聚糖濃度為 15 mg/mL, 油水比為 50:1，表面活性劑為油相體積的 3%，交聯(lián)劑濃度為