【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 存在不盡如意的地方 [24]。近年來(lái)，生物大分子材料由于其可再生性，無(wú)毒性以及良好的生物相容性，生物可降解性和黏膜粘附性等優(yōu)點(diǎn)成為藥物載體研究的熱點(diǎn)，于是利用生物大分子材料來(lái)制備納米藥物載體的研究應(yīng)運(yùn)而生。用于納米藥物載體的生物大分子主要包含蛋白質(zhì)和多糖兩大類。蛋白質(zhì)一般包括如明膠，白蛋白，絲蛋白等物質(zhì)，多糖類一般包括如殼聚糖，海藻酸 鈉，環(huán)糊精，果膠等物質(zhì)。由于生物大分子可以從自然界的動(dòng)植物中獲得，生物相容性良好，并且可被生物體內(nèi)的酶降解，毒副作用較小，且分子上帶有的羥基，氨基，羧基等大量可反應(yīng)的官能團(tuán)，可作為化學(xué)修飾的位點(diǎn)，因此它們作為藥物載體材料具有廣闊的應(yīng)用前景 [25]。 殼聚糖 納米粒子 在納米藥物載體領(lǐng)域的制備和應(yīng)用 殼聚糖的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 殼聚糖也稱為甲殼胺或幾丁聚糖殼聚糖，是一種天然的生物高分子線性多氨基多糖，為甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物。在自然界中，殼聚糖廣泛存在于低等植物菌類，藻類的細(xì)胞，節(jié)肢動(dòng)物蝦，蟹，蠅蛆和昆蟲(chóng)的外殼，貝類，軟體動(dòng)物（如魷魚，烏賊）的外殼殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 5 和軟骨，高等植物的細(xì)胞壁等，每年生物合成的資源量高大 100 億 t，是地球上僅次于植物纖維的第二大生物資源 [26]。殼聚糖的化學(xué)名稱為 (14)2氨基 2 脫氧 D葡聚糖，甲殼素的化學(xué)名稱為 (14)2乙酰胺基 2 脫氧 D葡聚糖 [27]。結(jié)構(gòu)式如圖 所示。 圖 殼聚糖與甲殼素的結(jié)構(gòu) (A) 甲殼素 (B)殼聚糖 殼聚糖的每個(gè) C6 單元均含有一個(gè)氨基，兩個(gè)自由羥基。由于氨基的存在，它是自然界中唯一帶正電荷的堿性多糖。它不溶于水和有機(jī)溶劑，但是能溶于 PH 的乙酸（ 13 %）溶液中 [28]。殼聚糖不與體內(nèi)組織產(chǎn)生異物反應(yīng)，在體內(nèi)被溶菌酶降解為對(duì)人體無(wú)毒的 N乙 酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖 [29]。曹等 [30]通過(guò)研究表明，殼聚糖無(wú)細(xì)胞毒性，不溶血，不致敏，生物相容性良好，可以滿足醫(yī)藥衛(wèi)生及化妝品原料的基本要求。 殼聚糖 納米粒子 的制備 殼聚糖緩釋體系主要分為：殼聚糖納米粒子，殼聚糖 微球 ，殼聚糖緩釋片，殼聚糖緩釋膜，殼聚糖緩釋凝膠 5 種類型 [26]。其中，殼聚糖 納米粒子 載藥體系比其他體系更具優(yōu)勢(shì)。它能保護(hù)包埋物免受外界環(huán)境影響，以及屏蔽味道，顏色或氣味，降低揮發(fā)性和毒性，控制可持續(xù)釋放，增加藥效等。近幾年殼聚糖 納米粒子 的 制備和應(yīng)用成為研究的熱點(diǎn) [31]。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 6 制備殼聚糖 納米粒子 的方法有多種 [32]，其選擇的依據(jù)受以下因素影響： ① 目標(biāo)粒徑分布； ② 有效成分的熱化學(xué)性質(zhì)與 穩(wěn)定性； ③ 有效成分的釋藥動(dòng)力學(xué)與重現(xiàn)性； ④ 載藥納米粒子 的穩(wěn)定性與毒性溶劑殘留。 (1)乳化交聯(lián)法 乳化交聯(lián)法是制備殼聚糖 納米粒子 的常用方法之一。它是利用殼聚糖的活性氨基基團(tuán)與醛類的醛基交聯(lián)，得到一種 Schiff 堿。其反應(yīng)機(jī)理如圖 。此法是將殼聚糖溶液加入含有表面活性劑的油相中形成 W/O 型乳劑，再加入一定量的交聯(lián)劑如戊二醛，甲醛，三聚磷酸鹽，檸檬酸鹽，硫酸鹽和京尼平等進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)固化，通過(guò)離心純化即可制得殼聚糖 納米粒子 [33]。操作流程如圖 。沈宏亮等 [34]利用乳化交聯(lián)法制備了左氧氟沙星羧甲基殼聚糖 納米粒子 ，并對(duì)殼聚糖 納米粒子 的體外釋藥性能進(jìn)行了深入的研究。 圖 殼聚糖交聯(lián)反應(yīng)方程式 C h i t os a n a qu e ou s s ol u t i onO il ph a s eE m u ls if ic a ti on ( W /O) e m u ls io nHa r de n in g of dr ople tsS e pa r a ti on of pa r ti c le sS ti r or U lt r a s ou n dC r os s li n kin ga g e n t 圖 乳化交聯(lián)法操作流程 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 7 采用乳化交聯(lián)法，可以通過(guò)控制含水液滴的大小來(lái)控制 納米粒子 的粒徑，最終產(chǎn)物納米粒子 的粒徑也取決于在形成乳液時(shí)的油相比，交聯(lián)程度等。 (2)噴霧干燥法 噴霧干燥法是以熱氣流干燥霧化液滴為基礎(chǔ)的。其操作流程如圖 。此法是將殼聚糖溶于酸性溶液中，再將藥物溶解或分散于該殼聚糖溶液，加入一定量的交聯(lián)劑，在惰性的熱氣流中噴霧干燥，當(dāng)液體通過(guò)蠕動(dòng)泵輸送到噴嘴后，壓縮空氣將液體霧化為小液滴，液滴與熱空氣被共同吹入一個(gè)腔體中，液滴中的酸迅速蒸發(fā)，從而形成殼聚糖含藥納米粒子 [33]。 納米粒子 的粒徑取決于噴嘴的直徑，噴嘴流率，霧化壓力，入口溫度和交聯(lián)程度等因素 [32]。 He 等 [35]將配置好的殼聚糖水溶液與一定比例的戊二醛水溶液混合均勻，然后進(jìn)行噴霧干燥，制備出的殼聚糖 納米粒子 粒徑在 312 μm之間。 圖 噴霧干燥法操作流程 (3)逐層自組裝 逐層自組裝法適用于制備球壁厚度可控的空心 納米粒子 。 納米粒子 的球殼是通過(guò)溶質(zhì)逐層沉降制得的。通過(guò)限制溶質(zhì)沉降次數(shù)可控制空心 納米粒子 的球殼厚度，除去 納米粒子 中的核物質(zhì)即可獲得所需的空心結(jié)構(gòu)。 Shao 等 [36]等將聚苯乙烯磺酸鈉 /殼聚糖聚電解質(zhì)溶液吸附于制備好的殼聚糖 納米粒子 模板表面，經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié) pH 值，層層沉積后，進(jìn)一步處理即可得到所需的殼聚糖 納米粒子 ，如圖 所示 [32]。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 8 圖 逐層自組裝反應(yīng)流程 (4)界面聚合法 界面聚合法是將含有親水性單體溶液（多元胺，多元酚，多元醇等）乳化分散在疏水性的有機(jī)溶劑中，然后加入溶于該有機(jī)溶劑的疏水性單體（多元酰氯，多元硫酰氯，多異氰酸酯等），使兩種單體在水 /油界面處發(fā)生縮聚反應(yīng)形成聚合物球殼。 Wang 等在溫和的條件下通過(guò)界面聚合法一步制備多糖 多肽復(fù)合空心 納米粒子 。先將殼聚糖與 α氨基NCA（ Ncarboxyanhydride）接枝共聚，再將一定量 L亮氨酸 NCA 分散至乙酸乙酯中，并用 Span80 乳化后與水溶性殼聚糖在一定條件下反應(yīng) 2 h，經(jīng)進(jìn)一步處理可得殼聚糖空心納米粒子 [32]。 圖 界面聚合法反應(yīng)流程 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 9 (5)沉淀法 沉淀法是利用殼聚糖不溶于堿性溶液的性質(zhì)制備 納米粒子 。制備的方法是將用高壓空氣將殼聚糖溶液吹入堿性溶液如氫氧化鈉，氫氧化鈉甲醇溶液或乙二胺溶液中，沉降形成 納米粒子 ，如圖 所示。然后用冷熱水交替洗滌提純產(chǎn)物。另一種操作方法為：在殼聚糖溶液中加入表面活性劑，然后再逐滴加入硫酸鈉溶液，攪拌或超聲 30 分鐘后，離心分離出產(chǎn)物。此法制備的殼聚糖 納米粒子 酸穩(wěn)定性較強(qiáng) [31]。 圖 沉淀法反應(yīng)示意圖 (6)其他制備方法 制備殼聚糖 納米粒子 的方法還有很多。溶劑蒸發(fā)法又稱液中干燥法，常用的溶劑蒸發(fā)法是根據(jù)聚合物與藥物的性質(zhì)制成乳液體系，形成穩(wěn)定乳液后，采用升溫，減壓抽提或連續(xù)攪拌等方法使有機(jī)溶劑擴(kuò)散進(jìn)入連續(xù)相并通過(guò)連續(xù)相和空氣的界面蒸發(fā)， 納米粒子 固化，并經(jīng)過(guò)處理最終得到載藥 納米粒子 的過(guò)程 [32]。目前最常用的方法是將殼聚糖醋酸溶液加入含表面活性劑的液體石蠟中，形成 W/O 型乳劑，升溫再減壓干燥除去溶劑，分離得到殼聚糖 納米粒子 。 Sinha 等 [28]采用此法制備了性質(zhì)優(yōu)良的殼聚糖 納米粒子 。常見(jiàn)的殼聚糖 納米粒子 制備方法還有離子凝膠法，反膠束法，殼聚糖包裹法和殼聚糖 納米粒子 乙酰化法等 [33]。 殼聚糖 納米粒子 的應(yīng)用 殼聚糖 納米粒子 在腫瘤治療方面應(yīng)用廣泛 [33] 。它的應(yīng)用主要有以下幾方面： (1)作為藥物載體，可包埋多種類型藥物 殼聚糖 納米粒子 由于其良好的生物相容性，生物降解性和低細(xì)胞毒性，被廣泛應(yīng)用于藥物載體方面。所包埋的常見(jiàn)藥物有：牛血清白蛋白（ BSA），青霉素，四環(huán)素，維生殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 10 素，胰島素等。 Hejazi 等采用乳化交聯(lián)法制備了包載四環(huán)素的殼聚糖 納米粒子 。經(jīng)沙鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性增加，能夠黏附在胃黏膜上。 Jaganathan 等 [37]采用乳化交聯(lián)法制備了載有破傷風(fēng)類毒素的殼聚糖 納米粒子 ，穩(wěn)定劑海藻糖能夠保持抗原蛋白質(zhì)的活性， 納米粒子 的包封率也從加入海藻糖前的 40%提高到 90%。 (2)緩控釋給藥 殼聚糖分子內(nèi)具有活性基團(tuán)氨基，可與含雙官能團(tuán)的醛類或酸酐類藥物發(fā)生化學(xué)交聯(lián)，使藥物大量分布于交聯(lián)結(jié)構(gòu)，緩慢釋放，包封在殼聚糖 納米粒子 內(nèi)的藥物具有明顯的緩釋，控釋特點(diǎn)。 Wang 等制備了殼聚糖胰島素 納米粒子 ，其包封率高達(dá) 70%，胰島素的化學(xué)穩(wěn)定性大于 95%，并且胰島素可以長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定釋放。 Chandy 等 [37]制備了殼聚糖包衣的 PLA/PLGA 納米粒子 ，用于 5氟尿嘧啶的腦膠質(zhì)瘤的靶向治療，研究發(fā)現(xiàn)所得 納米粒子 表面孔空隙率低，藥物初次突釋后呈典型的二相釋藥，可靶向結(jié)合腦膠質(zhì)瘤，且穩(wěn)定釋放 30 d 以上。 (3)增加藥物的靶向性 殼聚糖本身具有一定的黏膜黏附性，通過(guò)控制殼聚糖 納米粒子 的大小，形狀，選擇適當(dāng)?shù)慕o藥方法，能夠提高殼聚糖 納米粒子 的靶向效果。李揚(yáng)等利用乳化分散法制備了左氧氟沙星羧甲基殼聚糖 納米粒子 ，體內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果表明所載藥物可如預(yù)想設(shè)計(jì)到達(dá)結(jié)腸定位釋放。 (4)降低藥物的毒副作用，提高療效 載有藥物的殼聚糖 納米粒子 循血液循環(huán)到達(dá)靶區(qū)周圍釋放藥物，使靶區(qū)周圍很快達(dá)到有效的治療藥物濃度，而在機(jī)體其他部位藥物的分布量較小，從而減少了對(duì)機(jī)體正常組織的毒副作用，同時(shí)由于載體殼聚糖本身具有一定的生理活性，且無(wú)毒，與藥物可產(chǎn)生協(xié)同作用增強(qiáng)療效。徐海濤等觀察了殼聚糖 順鉑緩釋 納米粒子 對(duì) C6膠質(zhì)瘤大鼠瘤內(nèi)化療的療效，結(jié)果表明，殼聚糖 順鉑 納米粒子 毒性小，安全性較高，療效可靠。 (5)提高疏水性藥物對(duì)細(xì)胞膜的通透性，增 強(qiáng)細(xì)胞吸收 殼聚糖 納米粒子 溶脹引起的擴(kuò)散釋藥過(guò)程可以增加藥物在吸收部位的濃度梯度，對(duì)藥物的吸收具有協(xié)同促進(jìn)作用。同時(shí)殼聚糖分子可以改變膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，打開(kāi)細(xì)胞通道，有利于提高藥物在細(xì)胞間瞬間滲透的能力，促進(jìn)藥物在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥效。 Mooren 等研究了潑尼松龍磷酸鈉殼聚糖 納米粒子 通過(guò)上皮細(xì)胞膜的情況，結(jié)果表明，殼聚糖 納米粒子可以改善上皮細(xì)胞膜對(duì)疏水性藥物通透性。 Mitra 等將 Doxorubicin（ DXR）包封于殼聚糖殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 11 納米粒子 中，不僅腫瘤實(shí)體內(nèi)藥物濃度提高，作用維持時(shí)間延長(zhǎng)，治療效果改善，不良反應(yīng)也明顯減輕。 (6)提高藥物的穩(wěn)定性 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因重組肽和蛋白質(zhì)藥物不斷涌現(xiàn)，應(yīng)用于臨床的種類也越來(lái)越多。與化學(xué)合成藥物相比，肽類藥物具有毒副作用輕，吸收快的特點(diǎn)，但由于此類藥物分子質(zhì)量大，在體內(nèi)外的穩(wěn)定性差，在胃腸道內(nèi)容易被酶降解，半衰期短，生物利用度極低，臨床應(yīng)用受限制。殼聚糖屬親水性聚合物，可制得不同大小的 納米粒子 ，將疫苗，蛋白質(zhì)，抗生素類藥物制成 納米粒子 系統(tǒng)給藥，不僅能有效防止藥物在體內(nèi)的快速降解，提高藥物的穩(wěn)定性，而且還能將藥物緩慢釋放并靶向送達(dá)體內(nèi)的作用部位，從而達(dá)到長(zhǎng)效緩釋靶向的目的。 Alexakis 等制備了小牛胸腺 DNA海藻酸酯 納米粒子 ，外面包覆殼聚糖制成載藥 納米粒子 后經(jīng)過(guò)胃腸道時(shí)藥物不被破壞， 60%DNA可以從糞便等排泄物中得到。 課題的研究意義與創(chuàng)新點(diǎn) 課題的研究意義 惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命的疾病。癌癥的化學(xué)預(yù)防是利用天然的或合成的化合物干預(yù)癌前病變，預(yù)防腫瘤的發(fā)生或使腫瘤細(xì)胞分化逆轉(zhuǎn)，從而達(dá)到預(yù)防惡性腫瘤的目的。目前癌癥化學(xué)預(yù)防研究的主要目標(biāo)就是尋找高效低毒，作用機(jī)制明確的化學(xué)預(yù)防藥物。硒代胱氨酸是一種新型高效的抗腫瘤藥物，生物活性高，對(duì)正常細(xì)胞毒性小。 但是研究表明， SeC 不易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的滲透性不強(qiáng)。因此，希望借助納米藥物載體來(lái)提高細(xì)胞吸收，減少它進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的時(shí)間。本文通過(guò)乳化交聯(lián)法制得殼聚糖 納米粒子 載體負(fù)載硒代胱氨酸，并對(duì) MCF7 進(jìn)行 體外抗腫瘤活性 實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，殼聚糖能夠增強(qiáng)硒代胱氨酸對(duì) MCF7 的細(xì)胞毒性，并在較短的時(shí)間內(nèi)起作用。 創(chuàng)新點(diǎn) 通過(guò)以 CSNPs 為載體，有效增強(qiáng) SeC 的體外抗腫瘤活性，并顯著縮短 SeC 對(duì) MCF7起作用的時(shí)間。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 12 第二章 空白殼聚糖納米粒子的制備 實(shí)驗(yàn)部分 材料與試劑 表 21 實(shí)驗(yàn)試劑 Table 21 Reagents used in experiment 試劑名稱 規(guī)格 產(chǎn)地 液體石蠟 AR 天津市化學(xué)試劑公司 Span80 CP 天津市化學(xué)試劑公司 殼聚糖 90 % MW=60000 上海伯奧生物科技有限公司 戊二醛 (25%) AR 天津市百世化工有限公司 甲苯 AR 天津市百世化工有限公司 無(wú)水乙醇 AR 天津市百世化工有限公司 石油醚