【正文】 實(shí)驗(yàn)儀器 表 32 實(shí)驗(yàn)儀器 Table 32 Apparatus used in experiment 儀器名稱(chēng) 型號(hào) 產(chǎn)地 電子天平 BP301S 德國(guó) Sartorius 公司 離心機(jī) Centrifuge 5804R Eppendorf 超聲破碎儀 JY92IIDN 寧波新芝生物科技股份有限公司 電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 Optima20xxDV 美國(guó) PerkinElmer 公司 納米粒度儀 NanoZS 英國(guó)馬爾文 (Malvern)公司 透射電子顯微鏡 TECNAI10 荷蘭 Philips 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 30 實(shí)驗(yàn)方法 由第二章空白殼聚糖納米粒子的制備條件優(yōu)化得出制備殼聚糖粒子的最佳條件，即殼聚糖濃度為 15 mg/mL, 油水比為 50:1，表面活性劑為油相體積的 3%，交聯(lián)劑濃度為3。 mg。 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)， 最終確定制備載藥殼聚糖納米粒子的最佳條件為：殼聚糖濃度為 15 mg/mL, 油水比為 50:1， 表面活性劑為油相體積的 3%，交聯(lián)劑濃度為 3%。通過(guò)各種表征方法分析各因素對(duì)殼聚糖 納米粒子 形成的粒徑與形貌的影響。 圖 不同交聯(lián)劑濃度 納米粒子 TEM 圖 Fig. TEM image of nanoparticles39。但濃度太大，導(dǎo)致局部濃度過(guò)大而使得局部液滴間也進(jìn)行交聯(lián)，造成粒徑分布不均勻，且粒徑增加。從 TEM 圖中可觀察到，當(dāng)交聯(lián)劑濃度較低時(shí)，一開(kāi)始局部進(jìn)行的是液滴內(nèi)交聯(lián)，隨后隨著交聯(lián)劑體積增加，進(jìn)行液滴間交聯(lián)，因此交聯(lián)得到的產(chǎn)物粒子分布不均勻，交聯(lián)效果差。 sizes (E1) % (E2) 1% (E3) 3% (E4) 5% (E5) 7% 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 28 (2)TEM 分析 TEM 觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。 sizes No. Glutaraldehyde aq Size() PdI E1 % E2 1% E3 3% E4 5% E5 7% 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 27 % 1% 3% 5% 7%04080120160200240280320 Size()V / m l 圖 不同交聯(lián)劑濃度對(duì) 納米粒子 粒徑 的 影響 Fig. Comparison of different glutaraldehyde concentration on nanoparticles39。但濃度太大，導(dǎo)致局部濃度過(guò)大而使得局部液滴間也進(jìn)行交聯(lián)，造成粒徑分布不均勻，且粒徑增加。當(dāng)交聯(lián)劑濃度較低時(shí)，交聯(lián)程度小，交聯(lián)效果差。 sizes ②不同交聯(lián)劑濃度 表 28 與圖 表明，殼聚糖納米粒子的粒徑與交聯(lián)劑的濃度有關(guān)。 ①同交聯(lián)劑體積 表 27 交聯(lián)劑 (1 %)體積對(duì) 納米粒子 粒徑的影響 Table 27Effect of G dosage on nanoparticles39。這可能是由于選擇的交聯(lián)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)適中，在體積較小時(shí)已經(jīng)能夠與殼聚糖交聯(lián)固化，當(dāng)體積增加時(shí)，多余的交聯(lián)劑不參加交聯(lián)。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 25 圖 不同殼聚糖濃度 納米粒子 TEM 圖 Fig. TEM images of nanoparticles39。殼聚糖濃度較大， 納米粒子 間粘連現(xiàn)象嚴(yán)重，造成產(chǎn)物粒徑大。從 TEM 圖中可觀察到，殼聚糖溶液濃度過(guò)小或過(guò)大，得到的產(chǎn)物粒徑均比較大。 sizes (C1) 10 mg/mL (C2) 15 mg/mL (C3) 20 mg/mL (C4) 25 mg/mL (2) TEM 分析 TEM 觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品后用磷鎢酸進(jìn)行染色，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。 sizes No. CS(mg/ml) size() PdI C1 10 C2 15 C3 20 C4 25 15 20 2504080120160200240280320 Size(m)m g/ m l 圖 殼聚糖濃度對(duì) 納米粒子粒徑的影響 Fig. Comparison of different CS concentration on nanoparticles39。這可能是由于殼聚糖濃度增加，粘度也隨著增加，殼聚糖間互相粘連使得乳化時(shí)分子較大，最終造成交聯(lián)得到的粒子 粒徑也變大。當(dāng)殼聚糖濃度為 15 mg/mL 時(shí)，產(chǎn)物的粒徑最小，分布性最好。由表 24 與圖 28可見(jiàn)，當(dāng)殼聚糖溶液濃度為 10 mg/ml 時(shí)，產(chǎn)物的粒徑達(dá)到了微米級(jí)。 圖 不同 Span80 用量納米粒子的 TEM 圖 Fig. TEM images of nanoparticles39。當(dāng)乳化劑用量適中，形成的乳滴分散均勻，交聯(lián)固化后形成的納米粒子 粒徑較小，且分布均勻， TEM 成像時(shí)襯度足夠，故磷鎢酸染 色后，仍呈黑色圓球。從 TEM 圖中可觀察到，當(dāng)表面活性劑用量較少或較多時(shí)，形成的 納米粒子 性狀不規(guī)則，并且粒徑較大。 sizes (B1) 2% (B2) 3% (B3) 4% (B4) 5% (B5) 6% (2)TEM 分析 TEM 觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品后用磷鎢酸進(jìn)行染色，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。 sizes No. Percentage Span80(g) Size() PdI B1 2% B2 3% B3 4% B4 5% B5 6% 2% 3% 4% 5%04080120160200240280320360 Size() 圖 不同 Span80 對(duì) 納米粒子 影響對(duì)比圖 Fig. Comparison of different Span80 dosage on nanoparticles39。結(jié)果表明，控制 span80 的用量為油相體積的 3%可以取得粒徑較小的產(chǎn)物。乳化劑的用量需要適中，太少 (2%)可能導(dǎo)致界面層太薄，膜強(qiáng)度不夠。在體系中加入乳化劑是殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 20 為了獲得穩(wěn)定的乳液。 shapes (A1) O/W=10:1 (A2) O/W=20:1 (A3) O/W=30: 1 (A4) O/W=40:1 (A5) O/W=50:1 表面活性劑用量對(duì)殼聚糖 納米粒子 的影響 (1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析 表 25 與圖 是不同油水比對(duì)殼聚糖納米粒子粒徑的影響。隨著油相體積增加，油包水乳液的油膜增厚，形成的乳滴較穩(wěn)定，且分散均勻，交聯(lián)固化后的產(chǎn)物呈圓球狀。隨著油水比的增加，粒子逐漸變小，形貌趨于規(guī)則的圓球。結(jié)果與納米粒度儀測(cè)得的平均粒徑大約相符。 sizes A 1A 2A 3A 4A 5 圖 不同油水比 納米粒子 的粒徑分布 Fig. Comparison of different ratio of paraffin to CS on nanoparticles39。 表 24 油水比對(duì)納米粒子 粒徑的影響 Table 24Effect of the ratio of paraffin to CS on nanoparticles 39。這可能是由于在油相體積較小時(shí)，水相 納米粒子 分散不均勻，存在 納米粒子 粘連現(xiàn)象，而交聯(lián)劑的加入使得這些 納米粒子 粘連現(xiàn)象加重，從 PdI和粒徑分布圖看出，油相體積比小時(shí) PdI 較大，分散不均勻。 sizes No. size() PdI paraffin toluene paraffin toluene 1 2 3 4 2 3 4 50100200300400500 t ol ue nepa ra ffi nV / m lSize() 圖 油相體系對(duì) 納米粒子粒徑的影響 Fig. Comparison of different oil phase on nanoparticles’ size 油水比對(duì)殼聚糖 納米粒子 的影響 (1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析 表 24 與圖 是不同油水比對(duì)殼聚糖納米粒子粒徑的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 油相體系對(duì)殼聚糖 納米粒子 的影響 (1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析 表 23 和圖 是不同的油相體系對(duì)殼聚糖 納米粒子 粒徑的影響 .從圖中可以看出，甲苯作為油相制備所得的納米粒子粒徑與 PdI 明顯比液體石蠟制得的粒子大，這可能與油相體系的粘度有關(guān)。 取 500 μL CS溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲 2 h處理后形成穩(wěn)定的 W/O 型微乳液，然后分別逐漸滴加 %， 1%， 3%， 5%， 7%的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 取 500 μL CS溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲 2h處理后形成穩(wěn)定的 W/O 型微乳液，然后分別逐漸滴加 2 mL， 3 mL， 4 mL， 5 mL， 6 mL 1 %的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 (5)不同交聯(lián)劑用量的選擇 水相：稱(chēng)取分子量為 60000 的殼聚糖（ 90%）的殼聚糖 375 mg 溶于 25 mL 2% 醋酸溶液中配制成濃度為 15 mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。 取 500 μL 不同濃度的 CS 溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲 2 h處理后形成穩(wěn)定的W/O 型微乳液，然后逐漸滴加 1%的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 15 (4)不同殼聚糖濃度的選擇 水相：分別稱(chēng)取分子量為 60000 的殼聚糖（ 90%）的殼聚糖 250 mg, 375 mg, 500 mg, 625 mg 溶于 25 mL 2% 醋酸溶液中配制成濃度分別為 10 mg/mL， 15 mg/mL， 20 mg/mL， 25 mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。 取 500 μL CS溶液緩慢滴加到含不同量 Span80 的油相溶液中，經(jīng)超聲 2 h處理后形成穩(wěn)定的 W/O 型微乳液，然后逐漸滴加 的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 (3)不同表面活性劑用量的選擇 水相：稱(chēng)取分子量為 60000 的殼聚糖（ 90%）的殼聚糖 500 mg，溶于 25 mL 2% 醋酸溶液中配制成 20 mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。 取 500 μL CS溶液緩慢滴加到不同體積的油相溶液中，經(jīng)超聲 2 h 處理后形成穩(wěn)定的W/O 型微乳液， 然后逐漸滴加 1%3 ml 的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 (2)不同油水比的選擇 水相：稱(chēng)取分子量為 60000 的殼聚糖（ 90%）的殼聚糖 500 mg，溶于 25 mL 2% 醋酸溶液中配制成 20 mg/ml的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。 取 500 μL CS溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲 2 h處理后形成穩(wěn)定的 W/O 型微乳液，然后逐漸滴加 1%的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 (1)不同油相體系的 選擇 水相： 稱(chēng)取分子量為 60000 的殼聚糖（ 90%）的殼聚糖 500 mg，溶于 25 mL 2% 醋酸溶液中配制成 20 mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。 由于采用乳液交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒子的影響因素有以下幾個(gè)：殼聚糖溶液濃度，油水比，表面活性劑用量， pH 值，攪拌速率，乳化時(shí)間，交聯(lián)劑用量，交聯(lián)時(shí)間和交聯(lián)溫度等。 實(shí)驗(yàn)方法 稱(chēng)取 CS 溶于 2%乙酸溶液中，攪拌