【正文】 Cell Biology, 2009, 41(3): 666676.131。 Engineering CBiomimetic and Supramolecular Systems, 2009, 29(3): 936941.[37] 魏海霞. 殼聚糖微球的制備及其在藥物載體中的應(yīng)用進(jìn)展 [J]. 中國(guó)新藥雜志, 2008, (13).[38] Chen, T,. Wong. Selenocystine induces caspaseindependent apoptosis in MCF7 human breast carcinoma cells with involvement of p53 phosphorylation and reactive oxygen species generation [J]. The International Journal of Biochemistry amp。amp。最后，感謝一直默默支持我，使我得以順利完成本科學(xué)業(yè)的父母。感謝論文指導(dǎo)老師鄭文杰教授及陳填烽教授的悉心指導(dǎo)，他們淵博的知識(shí)和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶W(xué)風(fēng)為我打開(kāi)了一扇探索科學(xué)的大門，感謝班主任曾向潮老師四年來(lái)的關(guān)心和幫助，謹(jǐn)此向老師們表達(dá)我由衷的謝意。而我們的研究將促進(jìn)殼聚糖納米粒子的發(fā)展，也將為生物醫(yī)藥研究提供科學(xué)依據(jù)。后續(xù)工作可以進(jìn)一步研究運(yùn)輸體系在細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程及提高SeC抗腫瘤活性的機(jī)制。 展望本論文通過(guò)考察影響殼聚糖納米粒子的五種因素，成功制備了負(fù)載SeC的納米粒子，并研究其對(duì)MCF7細(xì)胞進(jìn)行體外抗腫瘤活性，結(jié)果表明殼聚糖納米粒子運(yùn)輸體系能有效提高SeC對(duì)MCF7乳腺癌細(xì)胞的體外抗腫瘤活性。2. 通過(guò)制備SeCCS納米粒子得知，SeCCS納米粒子的粒徑與投藥量成正比，粒徑越大，載藥率越高，但包封率反而降低。最后考察了殼聚糖納米粒子作為載體負(fù)載SeC與SeC對(duì)MCF7乳腺癌細(xì)胞的抑制作用。本課題的研究結(jié)果將為開(kāi)發(fā)更多殼聚糖載體負(fù)載藥物提供科學(xué)依據(jù)。隨著SeC濃度增加，細(xì)胞固縮凋亡更加嚴(yán)重，表明了殼聚糖納米載體能夠增強(qiáng)SeC的腫瘤活性。結(jié)果表明，殼聚糖作為藥物載體，能夠大大增強(qiáng)SeC對(duì)MCF7細(xì)胞的抑制作用。 載藥殼聚糖納米粒子的TEMEDX分析A. TEM圖 B. EDX分析 載藥率與包封率通過(guò)ICPAES測(cè)得 mg/L, 計(jì)算得出包封率 = %；載藥率=% 細(xì)胞存活率通過(guò)MTT法分別測(cè)試24h殼聚糖負(fù)載SeC納米粒子和SeC對(duì)MCF7乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。如圖22B所示，Se原子的存在表明SeC已經(jīng)成功的結(jié)合到殼聚糖納米粒子上。以對(duì)照組OD570為100%，計(jì)算藥物處理組細(xì)胞存活率，同時(shí)作圖求得半數(shù)抑制濃度(IC50)。步驟如下： %胰蛋白酶消化MCF7貼壁細(xì)胞3 min制成單細(xì)胞懸液，在96孔培養(yǎng)板以20000個(gè)細(xì)胞/孔接種，置于培養(yǎng)箱中(37 ℃，5% CO2)預(yù)培養(yǎng)24 h后，加入含有不同濃度載藥殼聚糖納米粒子的培養(yǎng)基各100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。 實(shí)驗(yàn)步驟（1）殼聚糖負(fù)載SeC納米粒子的制備根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)，制備殼聚糖負(fù)載SeC納米粒子用于細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，CS:SeC = 2:1,制備納米粒子方法同實(shí)驗(yàn)三。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。L/孔，繼續(xù)培養(yǎng)5 h后抽掉上清液，加入DMSO 100 181。L，培養(yǎng)24 h后，再分別加入不同濃度的被測(cè)化合物100 181。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比[38]。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，但死細(xì)胞無(wú)此功能。將細(xì)胞懸浮在DMEM培養(yǎng)基中，加100 units/mL的青霉素、胎牛血清 (10%) 和鏈霉素 (50 units/mL) 置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。玻璃儀器均經(jīng)超聲清洗40分鐘，所有反應(yīng)均在室溫中（25 ℃）進(jìn)行。第四章 體外抗腫瘤活性的研究 實(shí)驗(yàn)部分 實(shí)驗(yàn)試劑表41實(shí)驗(yàn)試劑Table41 Reagents used in experiment試劑名稱規(guī)格產(chǎn)地液體石蠟AR天津市化學(xué)試劑公司Span80CP天津市化學(xué)試劑公司殼聚糖90 % MW=60000上海伯奧生物科技有限公司硒代胱氨酸ARSigma公司戊二醛(25%)AR天津市百世化工有限公司石油醚AR天津市百世化工有限公司MTT ARCell Signaling TechnologyDMEBARSigma公司DMSOAR天津市百世化工有限公司實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水，藥品稱量均使用德國(guó)Sartorius 公司的電子分析天平，誤差為177。隨著投藥量的增加，產(chǎn)物的粒徑增加，載藥率也隨著增加，但是包封率卻減少。但是包封率隨著載藥率增加而減少，這是由于藥物比例越大時(shí)，殼聚糖含量相對(duì)減少，不利于藥物包裹。從表34中可以看到，產(chǎn)物的載藥率隨著投藥量的增加而增加。從TEM圖中可觀察到，殼聚糖納米粒子包裹了一定量的SeC,且粒徑隨著投藥量的增加而增加。 sizeNo.CS:LSeCSize()PdIF14:1 F22:1 F31:1 SeC投藥量對(duì)納米粒子粒徑的影響Fig. Comparison of ratio of CS to SeC on nanoparticles’ size 不同SeC投藥量納米粒子粒徑分布圖Fig. Comparison of ratio of CS to SeC on nanoparticles’ size(F1)CS:LSeC=4:1 (F2) CS:LSeC=2:1 (F3) CS:LSeC=1:1 SeCCSNPs在水溶液條件下的粒徑變化以及第1天的粒徑分布我們制備得到的納米粒子具有強(qiáng)的穩(wěn)定性，能在水溶液條件下穩(wěn)定存在7天，并且分布均勻。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析，殼聚糖納米粒子的粒徑隨著硒代胱氨酸含量的增加而增加，這可能是由于加入的是硒代胱氨酸溶液，相當(dāng)于稀釋了殼聚糖溶液，殼聚糖濃度減少，單位含量少，乳化分散后與交聯(lián)劑交聯(lián)得到的粒子結(jié)構(gòu)松散，不致密，因此粒徑較大。②油相的配配制量取液體石蠟25 mL，加入占其體積3% ( g) 的Span80,攪拌均勻后備用。硒代胱氨酸溶液的配制：取15 mg mL HCl (1M)溶液中配配制成濃度為10 mg/ml的硒代胱氨酸溶液。根據(jù)此條件，進(jìn)行殼聚糖納米粒子的載藥制備。玻璃儀器均經(jīng)超聲清洗40分鐘，所有反應(yīng)均在室溫中（25 ℃）進(jìn)行。第三章 殼聚糖納米粒子負(fù)載硒代胱氨酸的制備 實(shí)驗(yàn)部分 實(shí)驗(yàn)材料表31實(shí)驗(yàn)試劑Table31 Reagents used in experiment試劑名稱規(guī)格產(chǎn)地液體石蠟AR天津市化學(xué)試劑公司Span80CP天津市化學(xué)試劑公司殼聚糖90 % MW=60000上海伯奧生物科技有限公司硒代胱氨酸ARSigma公司戊二醛(25%)AR天津市百世化工有限公司無(wú)水乙醇AR天津市百世化工有限公司石油醚AR天津市百世化工有限公司冰醋酸AR天津市百世化工有限公司實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水，藥品稱量均使用德國(guó)Sartorius 公司的電子分析天平，誤差為177。由粒徑分布圖看出，殼聚糖納米粒子粒徑與油水相比成反比，與表面活性劑用量成正比，與殼聚糖濃度與成正比，與交聯(lián)劑濃度成正比，與油相體系的粘度成反比。 shapes of different glutaraldehyde concentration(E1) % (E3) 3% (E5) 7% 本章小結(jié)通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，表明乳液交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒子受到幾個(gè)因素的影響——不同油相體系，油水相比例，表面活性劑用量，殼聚糖濃度以及交聯(lián)劑用量。綜上，選擇3 %的戊二醛溶液交聯(lián)時(shí)得到的產(chǎn)物粒徑較小，形貌好，且分布均勻。隨著交聯(lián)劑濃度的增加，交聯(lián)程度增大，交聯(lián)結(jié)構(gòu)緊密。結(jié)果與納米粒度儀測(cè)得的平均粒徑大約相符。 sizes 不同交聯(lián)劑濃度納米粒子粒徑分布圖Fig. Comparison of different glutaraldehyde concentration on nanoparticles39。表28 交聯(lián)劑濃度對(duì)納米粒子粒徑的影響Table 28Effect of G’s concentration on nanoparticles39。隨著交聯(lián)劑濃度的增加，交聯(lián)程度增大，交聯(lián)結(jié)構(gòu)緊密。戊二醛結(jié)構(gòu)中存在著兩個(gè)活潑的醛基，有很高的反應(yīng)活性，易與殼聚糖分子中的自由氨基反應(yīng)，形成交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 sizesNo.Glutaraldehyde aq(1%)/mlSize()PdID12 D23 D34 D45 D56 不同交聯(lián)劑體積對(duì)納米粒子粒徑的影響Fig. Comparison of different glutaraldehyde volume on nanoparticles39。也可能是由于隨著交聯(lián)劑體積的增加，交聯(lián)得到的殼聚糖納米粒子結(jié)構(gòu)松散，粒徑分布不均勻，在洗滌過(guò)程中，大的粒子聚集沉淀被洗去，剩下粒徑比較小的殼聚糖納米粒子，因此殼聚糖納米粒子的粒徑與交聯(lián)劑的體積無(wú)關(guān)。 shapes of different CS concentration(C1) 10 mg/mL (C2) 15 mg/mL (C3) 20 mg/mL 交聯(lián)劑用量對(duì)殼聚糖納米粒子的影響(1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析，改變交聯(lián)劑的體積對(duì)殼聚糖納米粒子的影響不呈規(guī)律性分布。因此，通過(guò)TEM圖表明，當(dāng)殼聚糖溶液濃度為15 mg/mL時(shí)，制備得到的殼聚糖納米粒子粒徑小，形貌好，且分布均勻。殼聚糖濃度較小，形成的納米粒子結(jié)構(gòu)松散。結(jié)果與納米粒度儀測(cè)得的平均粒徑大約相符。 sizes 不同殼聚糖濃度的納米粒子粒徑分布圖Fig. Comparison of different CS concentration on nanoparticles39。表26殼聚糖濃度對(duì)納米粒子粒徑的影響Table 26Effect of CS concentration on nanoparticles39。隨著殼聚糖溶液濃度的增加，產(chǎn)物的粒徑也增加，分散性變差，且顏色加深，由白色逐漸變成棕黃色。這可能是由于殼聚糖溶液濃度過(guò)低，水相液滴中所含的殼聚糖量極少，乳化分散后與交聯(lián)劑交聯(lián)得到的粒子結(jié)構(gòu)松散，不致密，因此粒徑較大。 shapes of different Span80 dosage(B1) 2% (B2) 3% (B4) 5% 殼聚糖濃度對(duì)殼聚糖納米粒子的影響(1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析。綜上，span80用量為油相體積的3%時(shí)，殼聚糖納米粒子的粒徑最小，形貌較好，且分布均勻。這可能是由于乳化劑過(guò)少或過(guò)多造成乳滴界面膜不穩(wěn)定，表面不均勻，存在凹陷，造成在TEM成像時(shí)的襯度太低，以致觀察不到物像，故需要磷鎢酸染色。結(jié)果與納米粒度儀測(cè)得的平均粒徑大約相符。 sizes 不同Span80用量納米粒子的粒徑分布Fig. Comparison of different Span80 dosage on nanoparticles39。表25 Span80用量對(duì)納米粒子的影響Table 25Effect of Span80 dosage on nanoparticles39。隨著乳化劑用量的增加，界面膜厚度和強(qiáng)度逐漸增加，過(guò)量會(huì)導(dǎo)致膜層太厚，不容易交聯(lián)，后續(xù)的洗滌也變得困難。乳化劑的加入，可以在油水界面上形成一層界面膜，降低乳滴的表面能，減少納米粒子粘連的幾率。從表跟圖中可以看出，當(dāng)span80用量為油相體積的3%時(shí)，殼聚糖納米粒子的粒徑最小。 不同油相比納米粒子的TEM圖Fig. TEM images of nanoparticles39。這可能是由于油相體積較小，乳化時(shí)殼聚糖溶液無(wú)法形成規(guī)則乳滴，造成交聯(lián)固化后的產(chǎn)物不規(guī)則。從TEM圖中可觀察到，當(dāng)油水比較小時(shí)，得到的粒徑較小，但是形貌不規(guī)則。 sizes(A1) O/W=10:1 (A2) O/W=20:1 (A3) O/W=30: 1 (A4) O/W=40:1 (A5) O/W=50:1 (2) TEM分析TEM（TEANAI10型透射電子顯微鏡，philips）觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品后用磷鎢酸進(jìn)行染色，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。 sizesNo.O/W(V/V)Paraffin(ml)Size()PdIA110:15 A220:110 A330:115 A440:120 A550:125 油水比對(duì)納米粒子的影響Fig. Comparison of different ratio of paraffin to CS on nanoparticles39。隨著油水相體