【正文】 溶液。取500 μL CS溶液緩慢滴加到含不同量Span80的油相溶液中，經(jīng)超聲2 h處理后形成穩(wěn)定的W/O型微乳液，然后逐漸滴加的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌3 h，8000 r/min離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。取500 μL CS溶液緩慢滴加到不同體積的油相溶液中，經(jīng)超聲2 h處理后形成穩(wěn)定的W/O型微乳液，然后逐漸滴加1%3 ml的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌3 h，8000 r/min離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。取500 μL CS溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲2 h處理后形成穩(wěn)定的W/O型微乳液，然后逐漸滴加1%的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌3 h，8000 r/min離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。由于采用乳液交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒子的影響因素有以下幾個(gè)：殼聚糖溶液濃度，油水比，表面活性劑用量，pH值，攪拌速率，乳化時(shí)間，交聯(lián)劑用量，交聯(lián)時(shí)間和交聯(lián)溫度等。散射角的大小與樣品的密度、厚度相關(guān)，因此可以形成明暗不同的影像。散射式納米粒度分析儀基于動(dòng)態(tài)光散射（DLS）技術(shù)，與激光散射儀中動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量粒徑分布的原理一樣，是借助光子相關(guān)原理（PCS)檢測(cè)因布朗運(yùn)動(dòng)及多普勒效應(yīng)產(chǎn)生的散射光的微小頻移而得到散射質(zhì)點(diǎn)動(dòng)態(tài)行為的信息技術(shù)。 ) ℃；常用的納米粒度儀均采用激光作光源，故納米粒度儀也稱激光納米粒度儀或激光粒度儀。 mg。因此，希望借助納米藥物載體來(lái)提高細(xì)胞吸收，減少它進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的時(shí)間。癌癥的化學(xué)預(yù)防是利用天然的或合成的化合物干預(yù)癌前病變，預(yù)防腫瘤的發(fā)生或使腫瘤細(xì)胞分化逆轉(zhuǎn)，從而達(dá)到預(yù)防惡性腫瘤的目的。與化學(xué)合成藥物相比，肽類藥物具有毒副作用輕，吸收快的特點(diǎn)，但由于此類藥物分子質(zhì)量大，在體內(nèi)外的穩(wěn)定性差，在胃腸道內(nèi)容易被酶降解，半衰期短，生物利用度極低，臨床應(yīng)用受限制。同時(shí)殼聚糖分子可以改變膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，打開(kāi)細(xì)胞通道，有利于提高藥物在細(xì)胞間瞬間滲透的能力，促進(jìn)藥物在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥效。李揚(yáng)等利用乳化分散法制備了左氧氟沙星羧甲基殼聚糖納米粒子，體內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果表明所載藥物可如預(yù)想設(shè)計(jì)到達(dá)結(jié)腸定位釋放。(2)緩控釋給藥殼聚糖分子內(nèi)具有活性基團(tuán)氨基，可與含雙官能團(tuán)的醛類或酸酐類藥物發(fā)生化學(xué)交聯(lián)，使藥物大量分布于交聯(lián)結(jié)構(gòu)，緩慢釋放，包封在殼聚糖納米粒子內(nèi)的藥物具有明顯的緩釋，控釋特點(diǎn)。所包埋的常見(jiàn)藥物有：牛血清白蛋白（BSA），青霉素，四環(huán)素，維生素，胰島素等。Sinha等[28]采用此法制備了性質(zhì)優(yōu)良的殼聚糖納米粒子。此法制備的殼聚糖納米粒子酸穩(wěn)定性較強(qiáng)[31]。 界面聚合法反應(yīng)流程(5)沉淀法沉淀法是利用殼聚糖不溶于堿性溶液的性質(zhì)制備納米粒子。Shao等[36]等將聚苯乙烯磺酸鈉/殼聚糖聚電解質(zhì)溶液吸附于制備好的殼聚糖納米粒子模板表面，經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)pH值，層層沉積后，進(jìn)一步處理即可得到所需的殼聚糖納米粒子，[32]。He等[35]將配置好的殼聚糖水溶液與一定比例的戊二醛水溶液混合均勻，然后進(jìn)行噴霧干燥，制備出的殼聚糖納米粒子粒徑在312 μm之間。 殼聚糖交聯(lián)反應(yīng)方程式 乳化交聯(lián)法操作流程采用乳化交聯(lián)法，可以通過(guò)控制含水液滴的大小來(lái)控制納米粒子的粒徑，最終產(chǎn)物納米粒子的粒徑也取決于在形成乳液時(shí)的油相比，交聯(lián)程度等。(1)乳化交聯(lián)法乳化交聯(lián)法是制備殼聚糖納米粒子的常用方法之一。其中，殼聚糖納米粒子載藥體系比其他體系更具優(yōu)勢(shì)。它不溶于水和有機(jī)溶劑，但是能溶于PH（13 %）溶液中[28]。在自然界中，殼聚糖廣泛存在于低等植物菌類，藻類的細(xì)胞，節(jié)肢動(dòng)物蝦，蟹，蠅蛆和昆蟲的外殼，貝類，軟體動(dòng)物（如魷魚，烏賊）的外殼和軟骨，高等植物的細(xì)胞壁等，每年生物合成的資源量高大100億t，是地球上僅次于植物纖維的第二大生物資源[26]。用于納米藥物載體的生物大分子主要包含蛋白質(zhì)和多糖兩大類。合成聚合物主要有聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸共聚乙醇酸（PLGA）、聚已內(nèi)酯（PCL）、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐等。一種理想的納米藥物載體應(yīng)具備以下特征[21] ：①具有較高的載藥量②具有較高的包封率 ③制備和純化方法簡(jiǎn)便，容易放大到工業(yè)化生產(chǎn) ④載體材料可生物降解，毒性較低或沒(méi)有毒性 ⑤具有適當(dāng)?shù)牧脚c粒型 ⑥具有較長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間納米藥物載體的種類有以下幾種（）：①納米聚合物藥物載體 ，包括：聚合物納米粒（納米囊和納米球）納米樹(shù)突狀聚合物和聚合物膠束②納米脂質(zhì)體藥物載體，③納米病毒藥物載體，④碳納米管[22]。隨著納米技術(shù)向醫(yī)學(xué)界不斷滲透，納米技術(shù)在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用，特別在腫瘤的診斷和治療方面，受到了廣泛的關(guān)注[17]。納米材料具有小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)，表面效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)四大效應(yīng)。 納米藥物載體在腫瘤治療中的應(yīng)用 納米技術(shù)的研究進(jìn)展早在1959年，著名物理諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Feynman就預(yù)言了納米科技的出現(xiàn)及前景。因此，SeC是一種新型高效的抗腫瘤藥物。 硒代胱氨酸的結(jié)構(gòu)式 硒代胱氨酸的抗癌作用SeC，是一種天然存在的含硒氨基酸，在化學(xué)預(yù)防與治療方面具有巨大的潛力。從此有機(jī)硒化合物的研究引起了廣泛關(guān)注，Shahd等人在2005年報(bào)道了有機(jī)硒化合物Methylseleninic acid (MSA)和它莫西芬一起可以治療子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌[13]。硒在生物體內(nèi)主要以有機(jī)硒化合物的形式存在，一類是含硒氨基酸，另一類是含硒蛋白質(zhì)。近年來(lái)，硒與硒化合物的抗腫瘤活性受到普遍關(guān)注，人們一直致力于設(shè)計(jì)和改造含硒化合物，以尋找抗腫瘤活性強(qiáng)，抗腫瘤譜廣，毒副作用低，適用于臨床的含硒抗腫瘤藥物[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，硒與人類40種疾病有關(guān)，如大骨節(jié)病、克山病、白內(nèi)障、癌癥等。1973年，Rotruck等人發(fā)現(xiàn)硒是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GSHPx的活性成分后[3]，已經(jīng)陸續(xù)有25種含硒蛋白被發(fā)現(xiàn)。 in vitro anticancer activity 目 錄摘 要 IAbstract II第一章 緒論 3 硒抗癌藥物的研究進(jìn)展 3 硒代胱氨酸的研究現(xiàn)狀 3 硒代胱氨酸的性質(zhì) 3 硒代胱氨酸的抗癌作用 3 納米藥物載體在腫瘤治療中的應(yīng)用 3 納米技術(shù)的研究進(jìn)展 3 納米藥物載體的研究進(jìn)展 3 殼聚糖納米粒子在納米藥物載體領(lǐng)域的制備和應(yīng)用 3 殼聚糖的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 3 殼聚糖納米粒子的制備 3 殼聚糖納米粒子的應(yīng)用 3 課題的研究意義與創(chuàng)新點(diǎn) 3 課題的研究意義 3 創(chuàng)新點(diǎn) 3第二章 空白殼聚糖納米粒子的制備 3 實(shí)驗(yàn)部分 3 材料與試劑 3 實(shí)驗(yàn)儀器 3 實(shí)驗(yàn)方法 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 3 油相體系對(duì)殼聚糖納米粒子的影響 3 油水比對(duì)殼聚糖納米粒子的影響 3 表面活性劑用量對(duì)殼聚糖納米粒子的影響 3 殼聚糖濃度對(duì)殼聚糖納米粒子的影響 3 交聯(lián)劑用量對(duì)殼聚糖納米粒子的影響 3 本章小結(jié) 3第三章 殼聚糖納米粒子負(fù)載硒代胱氨酸的制備 3 實(shí)驗(yàn)部分 3 實(shí)驗(yàn)材料 3 實(shí)驗(yàn)儀器 3 實(shí)驗(yàn)方法 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 3 粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析 3 TEM分析 3 包封率與載藥率的計(jì)算 3 本章小結(jié) 3第四章 細(xì)胞毒性的研究 3 實(shí)驗(yàn)部分 3 實(shí)驗(yàn)試劑 3 實(shí)驗(yàn)儀器 3 實(shí)驗(yàn)原理 3 實(shí)驗(yàn)步驟 3 結(jié)果與討論 3 粒徑分布 3 TEM分析與EDX分析 3 載藥率與包封率 3 細(xì)胞存活率 3 本章小結(jié) 3第五章 總結(jié)與展望 3 總結(jié) 3 展望 3致 謝 3參考文獻(xiàn) 3IV殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其體外抗腫瘤活性的研究第一章 緒論 硒化學(xué)的研究進(jìn)展硒是機(jī)體生命活動(dòng)不可缺少的一種微量元素，被稱為“生命奇效元素”[1]。最后通過(guò)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，表明以殼聚糖納米粒子為藥物載體能夠增強(qiáng)SeC對(duì)MCF7乳腺癌細(xì)胞的抑制作用，并增強(qiáng)其體外抗腫瘤活性。然而，SeC進(jìn)入腫瘤細(xì)胞與其作用需要較長(zhǎng)一段時(shí)間，細(xì)胞滲透性較差。高分子載藥納米粒子是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新劑型，藥物經(jīng)其包裹后，不僅可以提高藥物穩(wěn)定性，而且還可以大大提高藥物的生物利用率。關(guān)鍵詞：殼聚糖納米粒子；乳化交聯(lián)法；硒代胱氨酸；體外抗腫瘤活性Preparation and in vitro anticancer activity of Selenocystineloaded chitosan nanoparticlesAbstractSelenocystine (SeC), a naturally occurring selenoamino acid, has been shown to be a novel pound with broadspectrum anticancer activity. However, it takes a long time for SeC to interact with cancer cells due to its poor solubility and stability. Polymer, a new drug carrier, is widely used in pharmaceutical field. The encapsulation of drug helps to improve drug stability as well as anticancer activity. Chitosan is a popular drug carrier due to its biopatible, biodegradable and nontoxic properties. In this paper, Chitosan loaded SeC nanoparticles were prepared in emulsion by using glutaraldehyde as crossing agent, span80 as emulsifier and paraffin as oil phase. Lastly, it’s proved that chitosan nanoparticles loaded SeC had greater toxicity and antitumor activity to MCF7.Key words: Chitosan nanoparticles。1817年，硒由瑞典學(xué)者Berzelius發(fā)現(xiàn)，并命名為Selenium。1975年Awasthi等人首次明確指出，硒是人體必需的微量元素[4]。硒可以保護(hù)心臟、肝臟等免受損傷，對(duì)癌癥、心血管疾病、艾滋病等起到治療和控制作用[57]。根據(jù)硒在自然界的存在形態(tài)，硒化合物可分為無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒化合物[10]。無(wú)機(jī)硒具有較好的抗癌活性，但無(wú)機(jī)硒化合物脂溶性差，不易進(jìn)入細(xì)胞，且具有蓄積毒性和致突變作用，限制了它在臨床上的應(yīng)用。 硒代胱氨酸的研究現(xiàn)狀 硒代胱氨酸的性質(zhì)硒代氨基酸在有機(jī)硒化合物中，有特殊的重要性。Chen等[15]通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較幾種含硒化合物對(duì)八種人類癌癥細(xì)胞的抗癌活性，實(shí)驗(yàn)證明，SeC與亞硒酸鹽對(duì)A375，MCF7，HepG2，SW620等癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性比硒代蛋氨酸，硒甲基硒氨酸，硒酸鹽等強(qiáng)。雖然SeC作為抗腫瘤藥物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，但是從Chen等[16]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SeC的水溶性與穩(wěn)定性較差，進(jìn)入MCF7細(xì)胞發(fā)揮作用的時(shí)間比較長(zhǎng)，36 h之后才觀察到明顯的細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，且72 h后的IC50=177。1990年7月，在美國(guó)巴爾的摩召開(kāi)了第一界國(guó)際納米科技會(huì)議，標(biāo)志著納米科技的正式誕生。當(dāng)物體達(dá)到納米級(jí)后，納米粒子在熱學(xué)、光學(xué)、磁學(xué)力學(xué)及電化學(xué)方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[18]。納米技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用主要表現(xiàn)在一下幾個(gè)方面：控釋載藥微粒，靶向載藥微粒，磁導(dǎo)航靶向載藥微粒，基因載體[20]。雖然，納米藥物載體作為載藥系統(tǒng)有諸多優(yōu)點(diǎn)，但仍存在一些問(wèn)題，如生物相容性以及細(xì)胞毒性等。天然高分子聚合物主要包括天然多糖，多肽以及其他親水性生物可降解聚合物[23]。蛋白質(zhì)一般包括如明膠，白蛋白，絲蛋白等物質(zhì)，多糖類一般包括如殼聚糖，海藻酸鈉，環(huán)糊精，果膠等物質(zhì)。殼聚糖的化學(xué)名稱為 (14)2氨基2脫氧D葡聚糖，甲殼素的化學(xué)名稱為(14)2乙酰胺基2脫氧D葡聚糖[27]。殼聚糖不與體內(nèi)組織產(chǎn)生異物反應(yīng)，在體內(nèi)被溶菌酶降解為對(duì)人體無(wú)毒的N乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖[29]。它能保護(hù)包埋物免受外界環(huán)境影響，以及屏蔽味道，顏色或氣味，降低揮發(fā)性和毒性，控制可持續(xù)釋放，增加藥效等。它是利用殼聚糖的活性氨基基團(tuán)與醛類的醛基交聯(lián)，得到一種Schiff堿。(2)噴霧干燥法噴霧干燥法是以熱氣流干燥霧化液滴為基礎(chǔ)的。 噴霧干燥法操作流程(3)逐層自組裝逐層自組裝法適用于制備球壁厚度可控的空心納米粒子。 逐層自組裝反應(yīng)流程(4)界面聚合法界面聚合法是將含有親水性單體溶液（多元胺，多元酚，多元醇等）乳化分散在疏水性的有機(jī)溶劑中，然后加入溶于該有機(jī)溶劑的疏水性單體（多元酰氯，多元硫酰氯，多異氰酸酯等），使兩種單體在水/油界面處發(fā)生縮聚反應(yīng)形成聚合物球殼。制備的方法是將用高壓空氣將殼聚糖溶液吹入堿性溶液如氫氧化鈉，氫氧化鈉甲醇溶液或乙二胺溶液中，沉降形成納米粒子。 沉淀法反應(yīng)示意圖(6)其他制備方法制備殼聚糖納米粒子的方法還有很多。常見(jiàn)的殼聚糖納米粒子制備