【正文】 釋凝膠5種類型[26]。其中，殼聚糖納米粒子載藥體系比其他體系更具優(yōu)勢(shì)。它能保護(hù)包埋物免受外界環(huán)境影響，以及屏蔽味道，顏色或氣味，降低揮發(fā)性和毒性，控制可持續(xù)釋放，增加藥效等。近幾年殼聚糖納米粒子的制備和應(yīng)用成為研究的熱點(diǎn)[31]。制備殼聚糖納米粒子的方法有多種[32]，其選擇的依據(jù)受以下因素影響：①目標(biāo)粒徑分布；②有效成分的熱化學(xué)性質(zhì)與穩(wěn)定性；③有效成分的釋藥動(dòng)力學(xué)與重現(xiàn)性；④載藥納米粒子的穩(wěn)定性與毒性溶劑殘留。(1)乳化交聯(lián)法乳化交聯(lián)法是制備殼聚糖納米粒子的常用方法之一。它是利用殼聚糖的活性氨基基團(tuán)與醛類的醛基交聯(lián)，得到一種Schiff堿。此法是將殼聚糖溶液加入含有表面活性劑的油相中形成W/O型乳劑，再加入一定量的交聯(lián)劑如戊二醛，甲醛，三聚磷酸鹽，檸檬酸鹽，硫酸鹽和京尼平等進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)固化，通過離心純化即可制得殼聚糖納米粒子[33]。沈宏亮等[34]利用乳化交聯(lián)法制備了左氧氟沙星羧甲基殼聚糖納米粒子，并對(duì)殼聚糖納米粒子的體外釋藥性能進(jìn)行了深入的研究。 殼聚糖交聯(lián)反應(yīng)方程式 乳化交聯(lián)法操作流程采用乳化交聯(lián)法，可以通過控制含水液滴的大小來控制納米粒子的粒徑，最終產(chǎn)物納米粒子的粒徑也取決于在形成乳液時(shí)的油相比，交聯(lián)程度等。(2)噴霧干燥法噴霧干燥法是以熱氣流干燥霧化液滴為基礎(chǔ)的。此法是將殼聚糖溶于酸性溶液中，再將藥物溶解或分散于該殼聚糖溶液，加入一定量的交聯(lián)劑，在惰性的熱氣流中噴霧干燥，當(dāng)液體通過蠕動(dòng)泵輸送到噴嘴后，壓縮空氣將液體霧化為小液滴，液滴與熱空氣被共同吹入一個(gè)腔體中，液滴中的酸迅速蒸發(fā)，從而形成殼聚糖含藥納米粒子[33]。納米粒子的粒徑取決于噴嘴的直徑，噴嘴流率，霧化壓力，入口溫度和交聯(lián)程度等因素[32]。He等[35]將配置好的殼聚糖水溶液與一定比例的戊二醛水溶液混合均勻，然后進(jìn)行噴霧干燥，制備出的殼聚糖納米粒子粒徑在312 μm之間。 噴霧干燥法操作流程(3)逐層自組裝逐層自組裝法適用于制備球壁厚度可控的空心納米粒子。納米粒子的球殼是通過溶質(zhì)逐層沉降制得的。通過限制溶質(zhì)沉降次數(shù)可控制空心納米粒子的球殼厚度，除去納米粒子中的核物質(zhì)即可獲得所需的空心結(jié)構(gòu)。Shao等[36]等將聚苯乙烯磺酸鈉/殼聚糖聚電解質(zhì)溶液吸附于制備好的殼聚糖納米粒子模板表面，經(jīng)過調(diào)節(jié)pH值，層層沉積后，進(jìn)一步處理即可得到所需的殼聚糖納米粒子，[32]。 逐層自組裝反應(yīng)流程(4)界面聚合法界面聚合法是將含有親水性單體溶液（多元胺，多元酚，多元醇等）乳化分散在疏水性的有機(jī)溶劑中，然后加入溶于該有機(jī)溶劑的疏水性單體（多元酰氯，多元硫酰氯，多異氰酸酯等），使兩種單體在水/油界面處發(fā)生縮聚反應(yīng)形成聚合物球殼。Wang等在溫和的條件下通過界面聚合法一步制備多糖多肽復(fù)合空心納米粒子。先將殼聚糖與α氨基NCA（Ncarboxyanhydride）接枝共聚，再將一定量L亮氨酸NCA分散至乙酸乙酯中，并用Span80乳化后與水溶性殼聚糖在一定條件下反應(yīng)2 h，經(jīng)進(jìn)一步處理可得殼聚糖空心納米粒子[32]。 界面聚合法反應(yīng)流程(5)沉淀法沉淀法是利用殼聚糖不溶于堿性溶液的性質(zhì)制備納米粒子。制備的方法是將用高壓空氣將殼聚糖溶液吹入堿性溶液如氫氧化鈉，氫氧化鈉甲醇溶液或乙二胺溶液中，沉降形成納米粒子。然后用冷熱水交替洗滌提純產(chǎn)物。另一種操作方法為：在殼聚糖溶液中加入表面活性劑，然后再逐滴加入硫酸鈉溶液，攪拌或超聲30分鐘后，離心分離出產(chǎn)物。此法制備的殼聚糖納米粒子酸穩(wěn)定性較強(qiáng)[31]。 沉淀法反應(yīng)示意圖(6)其他制備方法制備殼聚糖納米粒子的方法還有很多。溶劑蒸發(fā)法又稱液中干燥法，常用的溶劑蒸發(fā)法是根據(jù)聚合物與藥物的性質(zhì)制成乳液體系，形成穩(wěn)定乳液后，采用升溫，減壓抽提或連續(xù)攪拌等方法使有機(jī)溶劑擴(kuò)散進(jìn)入連續(xù)相并通過連續(xù)相和空氣的界面蒸發(fā)，納米粒子固化，并經(jīng)過處理最終得到載藥納米粒子的過程[32]。目前最常用的方法是將殼聚糖醋酸溶液加入含表面活性劑的液體石蠟中，形成W/O型乳劑，升溫再減壓干燥除去溶劑，分離得到殼聚糖納米粒子。Sinha等[28]采用此法制備了性質(zhì)優(yōu)良的殼聚糖納米粒子。常見的殼聚糖納米粒子制備方法還有離子凝膠法，反膠束法，殼聚糖包裹法和殼聚糖納米粒子乙?；ǖ萚33]。 殼聚糖納米粒子的應(yīng)用殼聚糖納米粒子在腫瘤治療方面應(yīng)用廣泛[33] 。它的應(yīng)用主要有以下幾方面：(1)作為藥物載體，可包埋多種類型藥物殼聚糖納米粒子由于其良好的生物相容性，生物降解性和低細(xì)胞毒性，被廣泛應(yīng)用于藥物載體方面。所包埋的常見藥物有：牛血清白蛋白（BSA），青霉素，四環(huán)素，維生素，胰島素等。Hejazi等采用乳化交聯(lián)法制備了包載四環(huán)素的殼聚糖納米粒子。經(jīng)沙鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性增加，能夠黏附在胃黏膜上。Jaganathan等[37]采用乳化交聯(lián)法制備了載有破傷風(fēng)類毒素的殼聚糖納米粒子，穩(wěn)定劑海藻糖能夠保持抗原蛋白質(zhì)的活性，納米粒子的包封率也從加入海藻糖前的40%提高到90%。(2)緩控釋給藥殼聚糖分子內(nèi)具有活性基團(tuán)氨基，可與含雙官能團(tuán)的醛類或酸酐類藥物發(fā)生化學(xué)交聯(lián)，使藥物大量分布于交聯(lián)結(jié)構(gòu)，緩慢釋放，包封在殼聚糖納米粒子內(nèi)的藥物具有明顯的緩釋，控釋特點(diǎn)。Wang等制備了殼聚糖胰島素納米粒子，其包封率高達(dá)70%，胰島素的化學(xué)穩(wěn)定性大于95%，并且胰島素可以長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定釋放。Chandy 等[37]制備了殼聚糖包衣的PLA/PLGA納米粒子，用于5氟尿嘧啶的腦膠質(zhì)瘤的靶向治療，研究發(fā)現(xiàn)所得納米粒子表面孔空隙率低，藥物初次突釋后呈典型的二相釋藥，可靶向結(jié)合腦膠質(zhì)瘤，且穩(wěn)定釋放30 d以上。(3)增加藥物的靶向性殼聚糖本身具有一定的黏膜黏附性，通過控制殼聚糖納米粒子的大小，形狀，選擇適當(dāng)?shù)慕o藥方法，能夠提高殼聚糖納米粒子的靶向效果。李揚(yáng)等利用乳化分散法制備了左氧氟沙星羧甲基殼聚糖納米粒子，體內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果表明所載藥物可如預(yù)想設(shè)計(jì)到達(dá)結(jié)腸定位釋放。(4)降低藥物的毒副作用，提高療效載有藥物的殼聚糖納米粒子循血液循環(huán)到達(dá)靶區(qū)周圍釋放藥物，使靶區(qū)周圍很快達(dá)到有效的治療藥物濃度，而在機(jī)體其他部位藥物的分布量較小，從而減少了對(duì)機(jī)體正常組織的毒副作用，同時(shí)由于載體殼聚糖本身具有一定的生理活性，且無毒，與藥物可產(chǎn)生協(xié)同作用增強(qiáng)療效。徐海濤等觀察了殼聚糖順鉑緩釋納米粒子對(duì)C6膠質(zhì)瘤大鼠瘤內(nèi)化療的療效，結(jié)果表明，殼聚糖順鉑納米粒子毒性小，安全性較高，療效可靠。(5)提高疏水性藥物對(duì)細(xì)胞膜的通透性，增強(qiáng)細(xì)胞吸收殼聚糖納米粒子溶脹引起的擴(kuò)散釋藥過程可以增加藥物在吸收部位的濃度梯度，對(duì)藥物的吸收具有協(xié)同促進(jìn)作用。同時(shí)殼聚糖分子可以改變膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，打開細(xì)胞通道，有利于提高藥物在細(xì)胞間瞬間滲透的能力，促進(jìn)藥物在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥效。Mooren等研究了潑尼松龍磷酸鈉殼聚糖納米粒子通過上皮細(xì)胞膜的情況，結(jié)果表明，殼聚糖納米粒子可以改善上皮細(xì)胞膜對(duì)疏水性藥物通透性。Mitra等將Doxorubicin（DXR）包封于殼聚糖納米粒子中，不僅腫瘤實(shí)體內(nèi)藥物濃度提高，作用維持時(shí)間延長(zhǎng)，治療效果改善，不良反應(yīng)也明顯減輕。(6)提高藥物的穩(wěn)定性隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因重組肽和蛋白質(zhì)藥物不斷涌現(xiàn)，應(yīng)用于臨床的種類也越來越多。與化學(xué)合成藥物相比，肽類藥物具有毒副作用輕，吸收快的特點(diǎn)，但由于此類藥物分子質(zhì)量大，在體內(nèi)外的穩(wěn)定性差，在胃腸道內(nèi)容易被酶降解，半衰期短，生物利用度極低，臨床應(yīng)用受限制。殼聚糖屬親水性聚合物，可制得不同大小的納米粒子，將疫苗，蛋白質(zhì)，抗生素類藥物制成納米粒子系統(tǒng)給藥，不僅能有效防止藥物在體內(nèi)的快速降解，提高藥物的穩(wěn)定性，而且還能將藥物緩慢釋放并靶向送達(dá)體內(nèi)的作用部位，從而達(dá)到長(zhǎng)效緩釋靶向的目的。Alexakis等制備了小牛胸腺DNA海藻酸酯納米粒子，外面包覆殼聚糖制成載藥納米粒子后經(jīng)過胃腸道時(shí)藥物不被破壞，60%DNA可以從糞便等排泄物中得到。 課題的研究意義與創(chuàng)新點(diǎn) 課題的研究意義惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命的疾病。癌癥的化學(xué)預(yù)防是利用天然的或合成的化合物干預(yù)癌前病變，預(yù)防腫瘤的發(fā)生或使腫瘤細(xì)胞分化逆轉(zhuǎn)，從而達(dá)到預(yù)防惡性腫瘤的目的。目前癌癥化學(xué)預(yù)防研究的主要目標(biāo)就是尋找高效低毒，作用機(jī)制明確的化學(xué)預(yù)防藥物。硒代胱氨酸是一種新型高效的抗腫瘤藥物，生物活性高，對(duì)正常細(xì)胞毒性小。但是研究表明，SeC不易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的滲透性不強(qiáng)。因此，希望借助納米藥物載體來提高細(xì)胞吸收，減少它進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的時(shí)間。本文通過乳化交聯(lián)法制得殼聚糖納米粒子載體負(fù)載硒代胱氨酸，并對(duì)MCF7進(jìn)行體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，殼聚糖能夠增強(qiáng)硒代胱氨酸對(duì)MCF7的細(xì)胞毒性，并在較短的時(shí)間內(nèi)起作用。 創(chuàng)新點(diǎn)通過以CSNPs為載體，有效增強(qiáng)SeC的體外抗腫瘤活性，并顯著縮短SeC對(duì)MCF7起作用的時(shí)間。第二章 空白殼聚糖納米粒子的制備 實(shí)驗(yàn)部分 材料與試劑表21實(shí)驗(yàn)試劑Table 21 Reagents used in experiment試劑名稱規(guī)格產(chǎn)地液體石蠟AR天津市化學(xué)試劑公司Span80CP天津市化學(xué)試劑公司殼聚糖90 % MW=60000上海伯奧生物科技有限公司戊二醛(25%)AR天津市百世化工有限公司甲苯AR天津市百世化工有限公司無水乙醇AR天津市百世化工有限公司石油醚AR天津市百世化工有限公司冰醋酸AR天津市百世化工有限公司實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水，藥品稱量均使用德國(guó)Sartorius 公司的電子分析天平，誤差為177。 mg。玻璃儀器均經(jīng)超聲清洗40分鐘，所有反應(yīng)均在室溫中（25 ℃）進(jìn)行。 實(shí)驗(yàn)儀器表22 實(shí)驗(yàn)儀器Table 22 Apparatus used in experiment儀器名稱型號(hào)產(chǎn)地電子天平BP301S德國(guó)Sartorius 公司離心機(jī)Centrifuge 5804REppendorf超聲破碎儀JY92IIDN寧波新芝生物科技股份有限公司納米粒度儀NanoZS英國(guó)馬爾文(Malvern)公司透射電子顯微鏡TECNAI10荷蘭Philips相關(guān)儀器原理（1）NanoZS型納米粒度儀英國(guó)馬爾文公司(Malvern) NanoZS型納米粒度儀，入射光為氦氖激光，波長(zhǎng)λ = 633 nm，入射角90176。，測(cè)量溫度( 177。 ) ℃；常用的納米粒度儀均采用激光作光源，故納米粒度儀也稱激光納米粒度儀或激光粒度儀。激光粒度分析法是根據(jù)激光照射到顆粒后，顆粒能使散射的激光產(chǎn)生衍射或散射的現(xiàn)象來測(cè)試粒度分布的。其依據(jù)的光學(xué)原理為Fraunhofer衍射和Mie散射理論，因此相應(yīng)的激光粒度分析儀分為激光衍射式和激光動(dòng)態(tài)散射式兩類。但是很多研究證明對(duì)于粒徑小于1 μm的顆粒，必須用Mie散射理論求解粒徑分布。散射式納米粒度分析儀基于動(dòng)態(tài)光散射（DLS）技術(shù)，與激光散射儀中動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量粒徑分布的原理一樣，是借助光子相關(guān)原理（PCS)檢測(cè)因布朗運(yùn)動(dòng)及多普勒效應(yīng)產(chǎn)生的散射光的微小頻移而得到散射質(zhì)點(diǎn)動(dòng)態(tài)行為的信息技術(shù)。測(cè)試范圍下限可達(dá)到1 nm，可測(cè)懸浮液、乳濁液、微乳液等體系。本論文中，利用納米粒度儀來快速、準(zhǔn)確方便地對(duì)納米溶膠樣品中顆粒的大小及分布、形態(tài)等進(jìn)行測(cè)定。(2) 透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡（Transmission electron microscope，TEM），型號(hào)TEANAI10型透射電子顯微鏡philips，或高分辨透射電子顯微鏡（High resolution transmission electron microscope，HRTEM)，它是把經(jīng)加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向，從而產(chǎn)生立體角散射。散射角的大小與樣品的密度、厚度相關(guān)，因此可以形成明暗不同的影像。本論文研究中以TEM觀察殼聚糖納米材料的結(jié)構(gòu)。 實(shí)驗(yàn)方法稱取CS溶于2%乙酸溶液中，攪拌使其溶解后備用。取500 μL CS溶液緩慢滴加到含有表面活性劑span80的的液體石蠟中，經(jīng)超聲處理后形成穩(wěn)定的W/O型微乳液，然后滴加一定量的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌3 h，離心，然后用無水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液（CSNPs）。由于采用乳液交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒子的影響因素有以下幾個(gè)：殼聚糖溶液濃度，油水比，表面活性劑用量，pH值，攪拌速率，乳化時(shí)間，交聯(lián)劑用量，交聯(lián)時(shí)間和交聯(lián)溫度等。本實(shí)驗(yàn)將選取不同殼聚糖溶液濃度，不同油水比，不同的表面活性劑用量以及不同的交聯(lián)劑用量，不同的油相體系，篩選出制備殼聚糖納米粒子的最佳工藝條件，用以后續(xù)的載藥制備。(1)不同油相體系的選擇（1）（2）（3）（4）（5）的方法是平行的，用最佳條件做就好了~水相：稱取分子量為60000的殼聚糖（90%）的殼聚糖500 mg，溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成20 mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。油相：分別選用液體石蠟，甲苯各25 mL，加入占其體積5%( g)的Span80,攪拌均勻后備用。取500 μL CS溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲2 h處理后形成穩(wěn)定的W/O型微乳液，然后逐漸滴加1%的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌3 h，8000 r/min離心，然后用無水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。（CSNPs）。(2)不同油水比的選擇水相：稱取分子量為60000的殼聚糖（90%）的殼聚糖500 mg，溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成20 mg/ml的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。油相：分別量取液體石蠟5 mL，10 mL，15 mL，20 mL，25 mL，加入占其體積5%的