【正文】 保藏菌種 ?活化 ?擴培 ?發(fā)酵 ?分離純化 ?成品 (酶 ) 固體發(fā)酵 液體發(fā)酵 一般工藝流程： ? 1．溫度操作過程盡可能在低溫 (０ ― ４ ℃ )下進行，溶液中存在無機鹽或有機溶劑時，更應如此，以防止蛋白質水解酶對目的酶的分解破壞。 ? ④將獲得的沉淀干燥，研磨成粉，加入適當?shù)姆€(wěn)定劑、填充劑等，做成粉末制劑。 ? ②除去出發(fā)酶液中的懸浮固形物．獲得澄清的酶液。 43 酶的分離純化 ? ? ①首先獲得出發(fā)酶液。 ? (三 )溶解氧 ? 在發(fā)酵過程中應連續(xù)不斷地供給無菌空氣，同時進行攪拌以增加培養(yǎng)基中溶解氧的含量。 (二 )pH值 ? 不同的微生物所需要的最適 pH不同。 ? ④縮短發(fā)酵周期，提高設備利用率，在利用固定化細胞發(fā)酵時，第二批次及以后批次的發(fā)酵周期縮短。例如，枯草桿菌堿性磷酸酶的合成受其催化產(chǎn)物無機磷酸的抑制 ? ① 產(chǎn)酶效率高 ，細胞被固定化后，只能在一定的空間范圍內生長繁殖，細胞密度增大，故可加快生化反應速度，提高產(chǎn)酶率。誘導物多為底物或底物類似物，如淀粉、蔗糖、纖維素分別是淀粉酶、蔗糖酶、纖維素酶的誘導物。 ? 4．生長因子生長因子是指細胞生長繁殖所必需的微量有機物質，包括維生素、氨基酸、嘧啶、嘌呤等，它們是構成輔酶的必需物質。無機氮包括各種銨鹽和硝酸鹽等。氮源分為有機氮和無機氮。 ? 一、菌種的活化和擴大培養(yǎng) ? (一 )菌種活化 ? (二 )菌種的擴大培養(yǎng) ? 二、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備 ? 1．碳源，碳源是指能向細胞提供碳素的含碳化合物。 ?酶的生產(chǎn)方法 ? –酶的產(chǎn)量高 –容易培養(yǎng)和管理 –產(chǎn)酶穩(wěn)定性好 –利于酶的分離純化 –安全可靠 ? ： –菌種保存機構 –篩選 ?菌種采集 ?菌種的分離、純化 ?菌種生產(chǎn)性能的檢定 –初篩：從已分離的菌種中挑出可產(chǎn)生目的酶的菌株。 – 化學合成法 ? 現(xiàn)在已可用肽合成儀來進行酶的化學合成。 42 酶的生物發(fā)酵生產(chǎn) – 發(fā)酵法 ? 利用細胞，主要是微生物細胞的生命活動而獲得所需的酶。 ? 例如，從動物胰臟中提取胰酶；從動物胃中提取胃蛋白酶等 。目前在動、植物資源豐富的地區(qū)，仍有使用價值。 ? –提取法 ? 采用各種提取、分離技術從動物、植物或微生物細胞或組織中將酶提取分離出來。 生命活動過程中的新陳代謝所涉及的各種 化學反應由各種酶的催化來實現(xiàn)。 其中固定化酶技術是酶工程的核心。 酶工程 化學酶工程 生物酶工程 自然酶 化學修飾酶 固定化酶 人工合成酶 克隆酶 突變酶 新酶 ? (一 )反應條件溫和 ? (二 )催化效率高 ? (三 )反應專一性強 ? (四 )反應可調節(jié)控制 一、產(chǎn)酶菌種的選育和保藏 ? （一）常用產(chǎn)酶微生物 ? (二 )菌種的分離篩選 ? 1．優(yōu)良菌種的特點 ? 一個優(yōu)良菌種應具備以下幾個條件：①繁殖快，產(chǎn)酶量高，生產(chǎn)周期短；②適應性強，容易培養(yǎng)和控制，便于管理和降低生產(chǎn)成本；③產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，不易退化，不易受噬菌體侵襲；④產(chǎn)生的酶容易分離純化；⑤菌種本身和代謝產(chǎn)物安全無毒，對生產(chǎn)人員、生產(chǎn)環(huán)境，酶的應用不會產(chǎn)生不良影響。 酶工程： 酶是基因工程、細胞工程、發(fā)酵工程和生化工程的研究對象和工具。 ? 高效率 比非催化高 108－ 1020倍 比非酶催化高 107－ 1013倍 ? 高度專一性 ? 反應條件溫和 ? 酶催化是可調控的 ? 酶工程 ? (enzyme engineering)即利用酶的催化作用，在一定的生物反應器中，將相應的原料轉化成所需的產(chǎn)品。 41酶工程原理和方法 酶是由生物體產(chǎn)生的具有催化劑活性的蛋白質 。 ? 定點突變技術。 ? 蛋白質工程的組成部分。 修飾 Nisin的生物防腐效應 (Nisin)乳酸鏈球菌素，是一種乳酸鏈球菌在代謝過程中合成和分泌的有較強抑菌作用的小分子肽，是目前研究最多，應用最廣，由乳酸菌產(chǎn)生的唯一能應用于商業(yè)化生產(chǎn)的細菌素。借助定點突變技術，研究人員確定了嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)生的新支鏈淀粉酶的活性中心。 提高酶的催化特性 研究人員對嗜熱脂肪芽孢桿菌的（蘇氨酸） TyrtRNA合成酶進行定位突變后，改變了其與底物結合的特異性，從而提高了催化效率。改變食品級酶的最適 pH值條件，使酶適應食品加工環(huán)境，在工藝控制上非常重要。 通過對蛋白質 中非必需的天門冬酰胺進行突變，有利于提高蛋白質的熱穩(wěn)定性。這種酶有兩個相同的亞基，每個亞基含有兩個天門冬酰胺，它們都位于亞基之間的界面上，對酶的熱穩(wěn)定性起決定性作用。 蛋白質晶體結構研究表明， T4溶菌酶分子由一條肽鏈構成，并在空間上折疊形成兩個相對獨立的單元，酶活性中心位于兩個單元之間，該酶分子的一個重要特性是在第 97位和第 54位殘基上是兩個未形成二硫鍵的半胱氨酸，所以野生性的溶菌酶是不含二硫鍵的蛋白質分子。 1985年，美國的埃斯特爾借助 PCR技術，用 19種其他氨基酸分別替換枯草芽孢桿菌蛋白酶分子第 222位殘基上容易受氧化的蛋氨酸，獲得了一系列活性差異很大的突變酶。 一般來說提高蛋白的穩(wěn)定性包括以下幾個方面：①延長酶的半衰期；②提高酶的熱穩(wěn)定性；③延長藥用蛋白質的保存期；④抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失。 167。 ? 成核作用是由于擠壓效應或疏水作用，多肽鏈中的一些小肽段迅速形成螺旋性的核心區(qū)； ? 折卷則是已成核的結構散落成為較大的超二級結構單元的集合體； ? 凝集則是集合體在原子水平凝集，形成致密的三級結構。核磁共振可以直接對水溶液中的蛋白質結構進行分析，溶液中的空間構象更接近于生物體中的自然狀態(tài)，更能反映蛋白質在執(zhí)行功能時的實際構象狀態(tài)。 33蛋白質工程的研究方法 ? 結構分析方法 ? 蛋白質的分離純化鑒定方法 ? 功能研究方法 ? 進行結構改造的分子生物學研究方法 ? 與研究蛋白質的空間結構有關的理論與技術 ? 蛋白質一級結構分析方法 ? 蛋白質構象研究方法 ? 蛋白質折疊過程研究方法 ? 蛋白質生物物理研究方法及計算機結構模擬研究 蛋白質一級結構研究，既氨基酸序列的測定，其原理是片段重疊、逐級降解、 cDNA以質譜法等幾種，其中片段重疊和逐級降解是最常用的方法。 ? 在深入了解某一個蛋白質結構與功能關系的基礎上，經(jīng)過有目標的、嚴格的分子設計，定向地改造或構建一個具有特定性質和功能的目的蛋白質。 ? 利用目的基因表型具有高效檢測篩選系統(tǒng)這一特性，在目標條件下從隨機誘變基因庫中分離出目標基因，最終獲得突變蛋白質。 167。 盡管蛋白質工程相關技術還很不成熟，但是這一生物技術已經(jīng)取得了令人矚目的成就，特別是在酶制劑的性質改良方面，取得了突破性進展。 有關蛋白質結構功能研究的理論和技術； 如準確地由一級機構推測高級機構、肽鏈折疊的精確控制，蛋白質的翻譯后修飾，蛋白質結構可變性，分子動力學與蛋白質功能的關系，蛋白質在晶體、液體以及細胞中的不同存在狀態(tài)及其對蛋白質性質、功能的影響等等。 通過這一過程的重復進行 ，最終符合目的蛋白質分子的結構 、 性質和功能設計的要求 。同時計算機輔助處理系統(tǒng)可以通過生物物理學原理 ， 模擬預測氨基酸序列的變化對蛋白質空間結構的影響 。主要包括以下兩大方面：分子遺傳學的相關理論與技術和蛋白質結構功能的相關的理論與技術。 蛋白質工程的出現(xiàn)是生物技術發(fā)展到現(xiàn)階段的必然產(chǎn)物 ， 同時也是社會生產(chǎn)實踐和生物科學研究的客觀需要 。 嚴格地說蛋白質工程就是以蛋白質結構和功能的研究為基礎，運用遺傳工程的方法，借助計算機信息處理技術的支持，從改變和合成基因入手，定向地改造天然蛋白質或設計全新的人工蛋白質分子，使之具有特定的結構、性質和功能，能更好地為人類服務的一種生物技術。這是新一代的基因工程，因而蛋白質工程也稱為第二代基因工程。 這些技術的融合 ， 促使了蛋白質工程這一新興生物技術領域的誕生 ， 為認識和改造蛋白質分子提供了強有力的手段 。 1972年 ， 美國斯坦福大學 Berg成功實現(xiàn)了 DNA重組實驗 ， 從此揭開了基因工程發(fā)展的序幕 ， 并逐步形成了以基因工程為核心內容 ，包括細胞工程 、 酶工程 、 發(fā)酵工程在內的一系列高新生物技術 。這種張力也是依靠酶分子中的許多非活性中心部位的協(xié)調作用而發(fā)生的。 一般來說 ， 蛋白質結構與功能的關系包含著兩個方面的問題： ① 蛋白質必須具備特定的結構 ， 才能表現(xiàn)特定的功能 ， 在蛋白質肽鏈中有一些基團對特定功能而言是必需基團 ， 另一些是非必需基團；② 在體內 ， 蛋白質分子是如何利用它的特定結構執(zhí)行特定的生物功能的 。 不少多肽和蛋白質分子，不論其是否由亞基組成，都能聚合成聚合物。 在特殊環(huán)境條件下 ， 某些具有四級結構的蛋白質分子之間 ， 一種蛋白質分子的亞基可以與另一種蛋白質的亞基聚合 ， 并產(chǎn)生有活性的雜交分子 。構成四級結構的原體可排列成二聚體、三聚體、四聚體、五聚體，最多可聚合成六十聚體等。 維持四級結構的主要力靠疏水鍵。由亞基聚合而成的蛋白質分子稱為寡聚蛋白。 從共價結構上看，亞基就是蛋白質分子的最小共價單位。 維持蛋白質構象的作用力有四種共價鍵類型： ① R基之間的氫鍵； ② 非極性 R基之間的疏水基相互作用 （ 范德華引力 ） ； ③ α 螺旋和 β 折疊中的肽鏈內或肽鏈間德氫鍵；④ 帶正負電荷的 R基之間的離子鍵 。環(huán)球蛋白是在三維空間中沿著多方向進行卷曲、折疊、盤繞而成的近似球形結構。在天然蛋白質變性時，往往就包含 α 螺旋向β 折疊的轉變。 β 折疊是一種肽鏈相對伸展的結構。二級結構不涉及氨基酸殘基的側鏈構象。如 α 螺旋、 β 折疊和β 轉角等。蛋白質的一級結構是最基本的，它包含著決定蛋白質的高級結構的關鍵性因素。蛋白質的肽鏈結構成為蛋白質的化學結構，它包括氨基酸組成、肽鏈數(shù)目、末端組成、氨基酸排列順序和二硫鍵位置等。蛋白質的分子構象又稱為空間結構、高級結構、立體結構、三維結構等等，是指蛋白質分子中所有原子在三維空間的擺布情況規(guī)律。 從蛋白質水解物中分離出來的氨基酸有 20種 ， 除了脯基酸外 ， 所有的氨基酸均可用下式表示： R （ NH2— CH— COOH） 一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基縮合失去一分子水，形成酰胺鍵，這種氨基酸之間連接的酰胺鍵又稱為肽鍵，一般由三個或三個以上的氨基酸殘基組成的肽稱為多肽。 shi和胨僅用于表示分子量較大但不確定的多肽混合物 。 在體內，蛋白質執(zhí)行著酶催化作用，使新陳代謝能有序地進行，從而表現(xiàn)出各種生命的現(xiàn)象；通過激素的調節(jié)代謝作用，以確保動物正常的生理活動；產(chǎn)生相應的抗體蛋白，使人和動物具有防御疾病和抵抗外界病原侵襲的免疫能力；構建成的各種生物膜，形成生物體內物質和信息交流的通路和能量轉換的場所。 31蛋白結構基礎和蛋白質工程的原理 蛋白質結構的基本構件 在自然界中，構成生命最基本的物質有蛋白質、核酸、多糖和脂類等生物大分子，其中蛋白質最為重要，核酸則最為根本?！笆斋@”工作比較復雜，這里不再介紹。 ? （ 5）篩選與培育，即基因表達產(chǎn)物的鑒定、收集和加工等一系列復雜過程的綜合。從這里就可以看出工具酶的重要性，沒有它們，重組工作就寸步難行。 ? (3)重組 DNA，即用人工方法，讓目的基因與運載體相結合，首先要用限制性內切酶和其他一些酶類，切割或修飾載體 DNA和目的基因，然后用連接酶將兩者連接起來，使目的基因插入載體內，形成重組 DNA分子。用人工方法，取得目的基因的適宜的載體，即質?；虿《尽＋@取目的基因是基因工程操作的關鍵。它的基本步驟可以大致歸納如下： 小結 ? （ 1）獲取目的基因，即用各種不同的方法取得人所需要的基因，也就是某些 DNA片段。 ?人類基因組計劃 ? 基因工程是一項非常復雜的技術操作，它的環(huán)節(jié)之繁多、操作之細致是其他工程所無法比擬的。 一、基礎理論研究： ?基因的結構與功能。 五、目的基因翻譯產(chǎn)物檢測 ? 最常用的是蛋白質印跡 (Westernblotting)法。 四、目的基因轉錄產(chǎn)物檢測 ? 用 RNA印跡 (Northern blotting)法檢測。因此，當 RNA探針及待測 DNA的混合物置于這種退火條件下， RNA便會同它的購 DNA分子中的互補序列退火形成穩(wěn)定的