【正文】 DNA—RNA雜交分子，而使被取代的 DNA鏈處于單鏈狀態(tài)。 (二 )R環(huán)檢測法 :采用 mRNA作探針，利用電子顯微鏡觀察其核酸雜交結果。經多種限制性內切酶切割分析，若兩種結果都一樣，可認為克隆子中克隆的是原定的目的基因，其核苷酸序列沒有變化。如果待測序的目的基因比較大，測序有困難，也可用 RFLP(限制性片段長度多態(tài)性 )技術。如果被檢測 DNA片段與核酸探針具有互補序列，就能在被檢測 DNA的條帶部位結合成雙鏈的雜交分子，并通過放射自顯影顯示出黑色條帶來。此方法常用于病毒核酸的定量檢測。 (二 )核酸雜交法 2．斑點印跡雜交 ? 斑點印跡雜交法與菌落印跡原位雜交的原理一樣，但方法更簡單、迅速，可直接將噬菌體的上清液或是由轉化子提取的DNA(RNA)樣品直接點在硝酸纖維素濾膜等固體支持物上，然后同核酸探針進行分子雜交。將這塊固定有 DNA印跡的濾膜干燥后，同放射性標記的特異性 DNA或 RNA探針雜交，漂洗除去多余的探針，最后經放射自顯影檢測雜交的結果。將影印的硝酸纖維素濾膜，用堿液處理，促使細菌細胞壁原位裂解、釋放出 DNA并隨之原位變性。而采用 DNA分子雜交的方法，只能在被雜交的 DNA中存在目的基因的一部分 DNA序列，就會出現(xiàn)雜交信號。即將目的基因重組體通過顯微注射裝置直接注入細胞核中。將 DNA或 RNA包裹于脂質體內，然后進行脂質體與細胞膜融合將基因導入。經過細胞膜融合，細菌內容物轉入動物細胞質中，質粒DNA被轉移到細胞核中。 導入方法 ? 5．原生質體融合。這是將外源基因導入哺乳類細胞中進行瞬時表達的常規(guī)方法?；钴S生長的細胞或菌絲體用消化細胞壁的酶 (如 driselase)處理變成球形體后，在適當濃度的聚乙二醇 6000(PEG一 6000)的介導下將外源 DNA轉化入受體細胞中。用電穿孔法實現(xiàn)基因導入比 CaCl2法方便，對細菌而言其轉化效率可達 109～ 1010轉化體／微克 DNA，但必須有專門儀器 導入方法 ? 3．聚乙二醇介導的原生質體轉化法。 導入方法 ? 2．高壓電穿孔法。如果用抗菌素篩選轉化體，作為對照的受體菌應該在此培養(yǎng)基上不生長。 導入方法 ? 注意以下幾點： (a)用作受體菌的細胞在培養(yǎng)時要掌握好細胞密度，一般在 OD 600為0． 4左右為好。這是將重組的質?；蚴删w DNA導入細菌中所用的常規(guī)方法，前者叫轉化 (transformation)后者叫轉染 (transfection)。 ? 7．細胞核的顯微注射法。 ? 5．原生質體融合。 ? 3．聚乙二醇介導的原生質體轉化法。 平末端連接 導入方法 ? 1． CaCl2處理后的細菌轉化或轉染。它是一類由人工合成的一頭具有某種限制性內切酶粘末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸片段。 ? 當然，在遇到這種情況時，一個方法可改用其它類型的銜接物，另一種公認的較好的替代辦法是改用DNA接頭 (adapter)連接法。接著用適當?shù)南拗泼赶哂秀暯游锏?DNA分子和克隆載體分子，這樣的結果使二者都產生出了彼此互補的粘性末端。 ? 所謂銜接物 (linker)，是指用化學方法合成的一段由10—12個核苷酸組成的、具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的寡核苷酸片段。 ? (3) 用銜接物連接平末端 DNA分子 ? 如果重組體 DNA是用 T4DNA連接酶的平末端連接或是用同聚物加尾構建的，那么就無法用原來的限制酶作特異的切割，因此也不能獲得插入 DNA片段。另外．由于添加了許多同聚物的尾巴，可能會影響外源基因的表達。③用任何一種方法制備的 DNA片段都可以用這種方法進行連接。 ? 優(yōu)點 在于：①不易自身環(huán)化，這是因為同一種DNA分子兩端的尾巴是相同的，所以不存在自身環(huán)化。 且外源 DNA不能原位刪除下來。這種反應的原因目前尚不清楚。 平末端連接 連接平末端 DNA分子的方法有 4種： （ 1）直接用 T4DNA連接酶連接； （ 2）先用 末端核苷酸轉移酶 ，給平末端 DNA分子加上同聚物尾巴之后再用 DNA連接酶進行連接； （ 3）用銜接物連接平末端 DNA分子； （ 4） DNA接頭連接法。 ? PCR法 PCR擴增法 黏性末端連接 平段連接 由同一種限制性核酸內切酶切割的不同 DNA 片段具有完全相同的末端； 由兩種不同的限制性核酸內切酶切割的 DNA片段具有相同類型的黏性末端； 黏性末端連接 ? 如果目的基因的 DNA片段是用限制性內切酶切割并有 黏性末端 ，則用同一種限制性內切酶處理載體 DNA，使其成為黏性末端。 基因的化學合成 ? 2．基因的化學一酶促合成： ? 此方法的特點是不需要合成組成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是合成其中一些片段，相鄰的 3’－末端有一短的順序相互補，在適當?shù)臈l件下通過退火形成模板－引物的復合體 (templateprimer plex)，然后在存在四種 dNTP的條件下，用E． coli的 DNA聚合酶 I大片段 (Klenow片段 )去填補互補片段之間的缺口，最后用 T4DNA連接酶連接及適當?shù)南拗菩詢惹忻盖懈詈笾亟M入載體 (圖 145)。 作為第一條鏈合成反應產物的 cDNA：mRNA雜交分子充當切口平移的模板。 ? (iii)引物一銜接頭法合成雙鏈 cDNA (圖 142) 。 ? cDNA文庫法 ? 以適當?shù)哪康幕蚱巫魈结?，利用高密度的噬菌斑或菌落原位雜交技術，從大量的噬菌斑或菌落中篩選出含有目的基因的重組體的噬菌斑或菌落，再經過擴增，提取其中的重組體，最后即可獲得所需要的目的基因片段。 ? 直接從基因組中分離目的基因的方法 ? 基因組文庫法 ? 以適當?shù)哪康幕蚱巫魈结槪酶呙芏鹊氖删呋蚓湓浑s交技術，從大量的噬菌斑或菌落中篩選出含有目的基因的重組體的噬菌斑或菌落，再經過擴增，提取其中的重組體，最后即可獲得所需要的目的基因片段。這一方法是繞過特定基因分離這一關口，用生物化學方法，如用限制性內切酶將基因組 DNA進行切割，得到很多在長度上同一般基因大小相當?shù)?DNA片段 (o． 8 106～9 106道爾頓 )。海膽 rDNA基因的分離就是一例。這樣，人們可以通過控制熔解使富 A=T區(qū)解鏈變性，而富 G≡C區(qū)仍維持雙鏈。 ? 外源基因 （ Foreign gene）：插入到載體內的非自身的 DNA片段 ? 基因化學合成法 ? 基因生物制備法 DNA自動合成儀 ? cDNA文庫法 ? PCR法 ? 基因組文庫法 ? 基因分離的物理化學方法 ? 鳥槍法 (shot gun) ? cDNA文庫的建立與基因的分離 ? 直接從特定的 mRNA分離基因 ? 基因組文庫的建立和基因的分離 ? 從蛋白質人手分離編碼此蛋白的基因 ? 基因化學合成法 ? 利用 PCR法或 RTPCR分離基因 基因分離的物理化學方法 ? 根據(jù) DNA分子的兩條鏈存在著 G≡C、 A=T(分別代表 GC間的三個氫鍵、 AT間二個氫鍵 )堿基配對。 多聚酶鏈式反應 PCR每個循環(huán)需要三步： ①變性 ②退火 ③延伸 ? 反應條件 多聚酶鏈式反應 ? 94℃ 變性 30s ? 55 ℃ 復性 30s ? 7072 ℃ 延伸 3060s ? 一共進行 30輪左右的循環(huán) 引物 (primer) 是一小段單鏈 DNA或 RNA，作為 DNA復制的起始點，存在于自然中生物的 DNA復制（ RNA引物）和聚合酶鏈式反應 (PCR)中人工合成的引物（通常為 DNA引物）。 隨機引物的探針標記 探針的末端標記 ? 是基因工程及分子生物學領域中最常用的基本技術之一 ? 是基于在適宜的溫度及離子強度等條件下，具有一定同源性的兩條核苷酸單鏈可按堿基互補原則復性雜交形成雙鏈的原理建立的 ? 雜交的兩條單鏈分別是核酸探針和待測核酸 核酸分子的雜交 核酸分子雜交的分類 ? 核酸原位雜交 ? 菌落原位雜交 ? 斑點狹縫雜交 ? 膜上吸印雜交 目前最常用的一種核酸分子雜交方法 膜上吸印雜交 原理：將待測核酸序列片段通過 吸印技術 轉移結合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相標記的核酸探針進行雜交并對其實行檢測的方法。 核酸分子探針的標記 ? 切刻平移法 ? 隨機引物法 ? 末端標記法 ? 隨機引物是指含有各種可能排列順序的寡聚核苷酸片斷的混合物。 ? 3．具有高容量的克隆能力 ? 柯斯質粒載體的克隆極限可達 45kb左右 ? 核酸分子探針的標記 ? 核酸分子的雜交 ? 多聚酶鏈式反應 核酸分子探針的標記 ? 探針是指在化學及生物學意義上能與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用，并可被特殊的方法所測定的分子。 ? 1．具有 λ噬菌體的特性 ? 高效地轉導 ， λ噬菌體 DNA同樣的方式環(huán)化起來 ，不能夠通過溶原周期，無法形成子代噬菌體顆粒。 柯斯質粒載體 ? 柯斯 (cosmid)質粒是一類由人工構建的質粒 —噬菌體雜合載體，它的復制子來自質粒、 cos位點序列來自 λ噬菌體，其克隆能力為 31～ 45kb，而且能夠被包裝成為具有感染性能的噬菌體顆粒?？刹迦腴L度約為 20kb的外源 DNA。 λ噬菌體載體的類型 ? 1．插入型載體 ? 插入型的 λ載體又分免疫功能失活和大腸桿菌 β半乳糖苷酶失活兩種亞型。這是將 DNA包裝到 λ噬菌體顆粒中所需的DNA序列。 ? 具有溶原周期的噬菌體稱為溫和噬菌體。 噬菌體載體 ? 噬菌體的生命周期分為溶菌周期和溶源周期。 ? 噬菌體是一類細菌病毒的總稱。當外源 DNA片段插入到質粒上的多克隆位點時，可使 β—半乳糖苷酶的氨基端片段失活，破壞 α互補作用。異丙基 —β—D—硫代半乳糖苷 (IPTG)可誘導該片段的合成，而該片段能與宿主細胞所編碼的缺陷型 β半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內互補 (a互補 )。 ? ③具有多克隆位點 MCS區(qū)段 MCS可以使兩種不同黏性末端的外源 DNA片段，無需借助其它操作而直接克隆到 pUC質粒載體上。 ? ①具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。 ＰＵＣ質粒載體 ? pUC系列的載體是通過 pBR322和 M13兩種質粒改造而來，它的復制子來自 pMBl， Amp’抗性基因則是來自 R質粒的轉座子。 pBR322 DNA分子中總共有 24種核酸內切酶只具有單一的酶切識別位點?？寺≥d體的分子量大小不要超過 10kb。 質粒載體的條件 一種理想的用作克隆載體的質粒必須滿足如下幾方面的條件。 pBR322質粒載體： “ P”表示是一種質粒； “ BR”表示兩位主要構建者姓氏的頭一個字母“ ”。 根據(jù)導入的受體生物。 ? 具有能夠直接觀察的表型特征 基因克隆載體具備條件 ? 克隆載體必須是安全的。 (二 )分子克隆中常用的其他工具酶 ? 甲基化酶 ? 末端轉移酶 ? 堿性磷酸酶 ? 逆轉錄酶 ? S1核酸酶 ? Bal31植酸酶 載體的功能 ： ? 運送外源基因高效轉入受體細胞 ? 為外源基因提供復制能力或整合能力 ? 為外源基因的擴增或表達提供必要的條件 ? Vector，本質是 DNA ? 攜帶外源基因進入到受體細胞的運載工具 基因克隆載體具備條件 ? 在克隆載體合適的位置含有允許外源 DNA片段組入的克隆位點，并且這樣的克隆位點應盡可能的多。 T7DNA聚合酶 ? 具有 5’→3’ 的聚合酶活性和 3’→5’ 的核酸外切酶活性 ? 主要用途： ? ①用于拷貝大分子量模板的引物延伸反應； ? ②如同 DNA聚合酶一樣，可通過單純的延伸或取代合成的途徑，標記 DNA的 3’末端，也可用來將雙鏈 DNA的 5’或 3’突出端轉變成平末端的結構。 主要用途 ? ① 可將任何形式的雙鏈 DNA制備成平末端的雙鏈 DNA。 ? ④ DNA序列測定。 ? ②對具有 3’隱蔽末端的 DNA片段作放射性末端標記。 原核生物主要有兩種類型的 DNA連接酶 ? E． coli DNA連接酶 ? T4DNA 連接酶 ? 催化反應能量來源 不同 ? T4DNA連接酶用 ATP，而 E． coliDNA連接酶則用 NAD ? 催化平末端連接的能力不同 ? 只有 T4DNA連接酶能夠連接兩條平末端的雙螺旋的 DNA片段