【正文】 (一 )常用的 DNA聚合酶： ? 大腸桿菌 DNA聚合酶 ? 大腸桿菌 DNA聚合酶Ｉ的 Klenow大片斷酶 ? T4噬菌體 DNA聚合酶 ? T7噬菌體 DNA聚合酶 ? Taq DNA聚合酶 催化 DNA體外合成反應(yīng) DNA聚合酶 DNA聚合酶 I(DNasel)是一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，具有三種不同的酶催活性，即 5’→ 3’的聚合酶活性、 5’→ 3’的核酸外切酶活性和 3’→ 5’的核酸外切酶活性。OH和 539。 ? 最常見(jiàn)的是 T4噬菌體 DNA連接酶 ? DNA連接酶 能夠催化 DNA鏈上彼此相鄰的3’羥基（ OH ）和 5’磷酸基團(tuán)（ P），形成磷酸二酯鍵。 ? 同裂酶指來(lái)源不同、而識(shí)別序列和切割方式均相同的核酸內(nèi)切酶。 切割位點(diǎn) ? 切割位點(diǎn)與其識(shí)別序列一致，在其識(shí)別序列內(nèi)切割 DNA。 限制性核酸內(nèi)切酶 ? 根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割ＤＮＡ的特點(diǎn)，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類： Ⅰ 型酶、 Ⅱ 型酶、 Ⅲ 型酶 ? Ⅰ 型酶不適合做基因工程的工具酶 ? Ⅲ 型酶在基因工程中也不常用 ? Ⅱ 型酶是基因工程理想的工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶 Ⅱ 型 限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 識(shí)別序列和切割位點(diǎn) 切割方式 同尾酶和同裂酶 限制性片段長(zhǎng)度： 經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的 DNA片段。 ⑥ 基因可以通過(guò)復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代 基因工程研究的理論依據(jù) ① 不同的基因有相同的物質(zhì)基礎(chǔ) ② 基因是可切割的 ③ 基因是可轉(zhuǎn)移的 ④ 多肽與基因之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系 ⑤ 遺傳密碼是通用的 基因工程技術(shù)路線 DNA片段的取得（目的基因的分離和制備） DNA片段和載體的連接 ——重組體 DNA 外源 DNA片段引入受體細(xì)胞 ——基因克隆和基因文庫(kù) 選擇基因（目的基因） 目的基因表達(dá) 切 接 轉(zhuǎn) 選 表達(dá) 限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶 DNA連接酶 基因的剪刀 基因的針線 ? 一類能夠識(shí)別和切割雙鏈 DNA分子內(nèi)核苷酸序列的內(nèi)切核酸酶。 基因工程的基本過(guò)程就是利用重組 DNA（ rebinant DNA）技術(shù)，在體外通過(guò)人工“剪切（ cut）”和“拼接（ splice）”等方法，對(duì)生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行增殖，并使重組基因在受體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類需要的基因。 ? 1972年 Berg創(chuàng)建了 DNA體外重組技術(shù)，這標(biāo)志著生物技術(shù)的核心技術(shù) ——基因工程技術(shù)的開(kāi)始。 ? 1953年美國(guó)學(xué)者 Watson和 Crick發(fā)現(xiàn)了 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)， 1958年 Crick又闡明了 DNA的半保留復(fù)制模式，從而奠定了現(xiàn)代分子生物學(xué)的基礎(chǔ)。 ? 現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展 ? 現(xiàn)代生物技術(shù)時(shí)期是以分子生物學(xué)的理論為先導(dǎo)，以 20世紀(jì) 70年代 DNA重組技術(shù)的建立為標(biāo)志的。 ? 主要包括酶的固定化技術(shù)、細(xì)胞固定化技術(shù)、酶的修飾改造技術(shù)及酶反應(yīng)器的設(shè)計(jì)技術(shù)等。 。 發(fā)酵工程 ? 發(fā)酵工程 (fermentation engineering)是指利用包括工程微生物在內(nèi)的某些微生物或動(dòng) 、 植物細(xì)胞及其特定功能 ， 通過(guò)現(xiàn)代工程技術(shù)手段 (主要是發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器的自動(dòng)化 、 高效化 、 功能多樣化 、 大型化 )生產(chǎn)各種特定的有用物質(zhì)；或者把微生物直接用于某些工業(yè)化生產(chǎn)的一種技術(shù) 。 細(xì)胞工程 ? 細(xì)胞工程 (cell engineering)是指以細(xì)胞為基本單位 ， 在體外條件下進(jìn)行培養(yǎng) 、 繁殖或人為地使細(xì)胞某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改 變 ， 從而達(dá)到改良生物品種和創(chuàng)造新品種的目的 ， 加速繁育動(dòng)植物個(gè)體 ， 或獲 得某種有用物質(zhì)的技術(shù) 。即按照人們的需要，用類似工程設(shè)計(jì)的方法將不同來(lái)源的基因 (DNA 分子 )在體外構(gòu)建成雜種 DNA分子，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù) 制、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的操作，也稱 DNA重組技術(shù)。 生物工程的種類 ? 基因工程 ? 細(xì)胞工程 ? 發(fā)酵工程 ? 酶工程 ? 蛋白質(zhì)工程 應(yīng)用： 農(nóng)業(yè)、環(huán)境、食品、醫(yī)藥等多個(gè)方面 基因工程 ? 也叫基因操作、遺傳工程或重組 DNA技術(shù)，是 20世紀(jì) 70年代以后興起的一門(mén)新技術(shù)。生物工程概論 動(dòng)物科技學(xué)院 第一章 緒論 第一節(jié) 生物工程的概述 ? 生物工程的產(chǎn)生及定義 ? 生物工程的種類 1 .1生物工程的產(chǎn)生及定義 生物工程概念的提出 ? 1917年匈牙利工程師提出： 用甜菜作為飼料進(jìn)行大規(guī)模養(yǎng)豬 ,及利用生物將原料轉(zhuǎn)化成為產(chǎn)品 . ? 19世紀(jì)：人類有意識(shí)的利用酵母進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)：酒精、面包酵母、檸檬酸 ? 1928年 發(fā)現(xiàn)青霉素，同時(shí)以獲取細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物 ——抗生素為主要特征的抗生素工業(yè)成為當(dāng)時(shí)生物技術(shù)的支柱產(chǎn)業(yè)。 20世紀(jì) 50年代 ? 氨基酸發(fā)酵工業(yè)成為生物工程的一個(gè)新成員 20世紀(jì) 60年代 ? 酶制劑工業(yè)的出現(xiàn) 20世紀(jì)末、 21世紀(jì)初 人類基因組測(cè)序酵母基因組測(cè)序、水稻基因組測(cè)序先后基本或全部完成，使生物技術(shù)發(fā)生了巨大的革命，逐步形成了以基因工程為核心的現(xiàn)代生物技術(shù) 生物工程定義的充實(shí) ? 1917：利用生物將原材料轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品 ? 1982：應(yīng)用自然科學(xué)及工程學(xué)的原理，依靠微生物、動(dòng)物、植物作為反應(yīng)器，將物料進(jìn)行加工以提供產(chǎn)品來(lái)為社會(huì)服務(wù)的技術(shù) ?生物工程的定義： 人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的，即現(xiàn)代生物工程技術(shù)。 ? 基因工程 (gene engineering) 是指在基因水平上的操作井改變生物遺傳特性的 技術(shù)。因此，由該技術(shù)構(gòu)建的且具有 新遺傳性狀的生物稱為基因工程生物或轉(zhuǎn)基因生物。細(xì)胞工程主要包括動(dòng)植物細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù) 、 細(xì)胞 融合技術(shù) (也稱細(xì)胞雜交技術(shù) )、 細(xì)胞器移植技術(shù)等 。由于發(fā)酵多與微生物密切聯(lián)系在一起 ， 所以又有微生物工程或微生物發(fā)酵工程之稱 。 酶工程 ? 利用酶、細(xì)胞器或細(xì)胞所具有的特異催化功能以及對(duì)酶進(jìn)行的修飾改造，并借助于生物反應(yīng)器生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品的一項(xiàng)技術(shù)。 蛋白質(zhì)工程 ? 蛋白質(zhì)工程 (protein engineering)這一名稱是 1981年由美國(guó)基因公司的 Ulmer提出的，它是指在基因工程的基礎(chǔ)上，結(jié)合蛋白質(zhì)晶體學(xué)、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)化學(xué)等多學(xué)科的基礎(chǔ)知識(shí)，通過(guò)對(duì)基因的人工定向改造等手段，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾、改造、拼接，以產(chǎn)生能滿足人類需要的新型蛋白質(zhì)的技術(shù)。 ? 1944年美國(guó)微生物學(xué)家 Avery等用實(shí)驗(yàn)證明了 DNA是遺傳信息的攜帶者。 ? 1961年 Nirenberg， 1965年 Holley， 1967年 Khorana分別對(duì) 20種常見(jiàn)氨基酸以及起始和終止密碼完成了破譯。 生物工程發(fā)展的趨勢(shì) ? 目前三個(gè)平臺(tái)： DNA重組、細(xì)胞培養(yǎng)和 DNA芯片 ? 未來(lái)將會(huì)形成的幾個(gè)新的平臺(tái) 第二章 基因工程 ? 基因工程基礎(chǔ) 內(nèi) 容 ? 基因工程研究 ? 基因工程的應(yīng)用 第一節(jié) 基因工程基礎(chǔ) ? 基因工程的定義、研究?jī)?nèi)容 ? 基因工程的工具酶 ? 基因工程的載體 ? 基因工程中的一些主要分子生物學(xué)方法 基因工程 gene engineering ? 運(yùn)用限制性內(nèi)切核酸酶、連接酶等酶類將不同 DNA進(jìn)行體外切割、連接構(gòu)成重組DNA，再將重組 DNA經(jīng)生物介導(dǎo)或直接導(dǎo)入等轉(zhuǎn)移方法引入受體細(xì)胞進(jìn)行克隆、表達(dá)，從而改變生物遺傳性以創(chuàng)造生物新種質(zhì)，或通過(guò)大量擴(kuò)增為人類提供有用產(chǎn)品等的技術(shù)。 基因工程是用人工的方法把不同生物的遺傳物質(zhì)（基因）分離出來(lái)，在體外進(jìn)行剪切、拼接、重組，形成基因重組體，然后再把重組體引入宿主細(xì)胞或個(gè)體中以得到高效表達(dá)，最終獲得人們所需要的基因產(chǎn)物。 ? restriction endonuclease ? 這類酶又簡(jiǎn)稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶 。 切割頻率： 某限制酶在該 DNA切割位點(diǎn)出現(xiàn)頻率 Ⅱ 型 限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 識(shí)別序列 ? 可識(shí)別長(zhǎng)度為 47bp的雙鏈 DNA特定序列，該識(shí)別序列（識(shí)別位點(diǎn)）常呈旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性。 Ⅱ 型 限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 切割方式 DNA的限制性酶切 Ⅱ 型 限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 ? 指來(lái)源不同、識(shí)別序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。 同尾酶和同裂酶 DNA連接酶 ? 能夠?qū)啥?DNA拼接起來(lái)的酶類 ? 原核生物主要有兩種類型的 DNA連接酶：E． coli DNA連接酶和 T4 DNA 連接酶。 DNA連接酶 ? DNA連接酶就可以用來(lái)在體外連接 DNA片段 ? DNA連接酶的作用 ? 是將雙螺旋 DNA分子的某一條鏈上兩個(gè)相鄰核苷酸之失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈缺口封閉起來(lái)，即催化 339。p之間形成磷酸二酯鍵，從而將具黏性末端的雙鏈 DNA、平末端雙鏈 DNA以及帶缺口的雙鏈 DNA連接起來(lái)。 主要用途是通過(guò) DNA缺口平移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的 DNA探針(圖 2—2) Klenow酶的主要用途 ? ① 修補(bǔ)經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化或其他方法所形成的 5’或 3’突出末端，制備平末端。 ? ③ cDNA克隆中的第二鏈 cDNA的合成。 T4DNA聚合酶 ? 這是由 T4噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物純化而來(lái)，具有兩種酶催活性，即 5’→3’ 的聚合酶活性和 3’→5’ 的核酸外切酶活性。 ? 外切酶的活性比 Klenow酶強(qiáng) 200倍，并且在高濃度的 dNTP存在時(shí)，降解作用即會(huì)停止 ? ②進(jìn)行雙鏈 DNA的 3’末端標(biāo)記。 修飾的 T7DNA聚合酶 ? 對(duì)天然的 T7DNA聚合酶進(jìn)行修飾，使之完全失去 3’→5’ 的核酸外切酶活性 ? 修飾的 T7DNA聚合酶的加工能力以及在單鏈模板上的聚合作用的速率增加了 3—9倍 ? 測(cè)序時(shí)常用此酶，故亦稱測(cè)序酶 TaqDNA聚合酶 ? 最適的活性溫度是 72℃ ，連續(xù)保溫 30min仍具有相當(dāng)?shù)幕钚? ? 在補(bǔ)加有四種脫氧核苷三磷酸的反應(yīng)體系中，能以高溫變性的靶 DNA分離出來(lái)的單鏈 DNA為模板，按 5’ →3’ 的方向合成新生的互補(bǔ)鏈 DNA。 ? 克隆載體能攜帶外源 DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，或停留在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行自我復(fù)制；或整合到染色體DNA、線粒體 DNA和葉綠體 DNA中，隨這些DNA同步復(fù)制。 ? 易于從宿主細(xì)胞中分離，并進(jìn)行純化。可以分為： ? 大腸桿菌載體 ? 植物載體 ? 酵母載體 ? 動(dòng)物載體 基因克隆載體分類 大腸桿菌載體 ? 質(zhì)粒載體 ? 噬菌體載體 ? 柯斯質(zhì)粒載體 將外源 DNA導(dǎo)入原核生物細(xì)胞 質(zhì)粒載體 質(zhì)粒（ plasmid）是指細(xì)菌等生物細(xì)胞內(nèi)一類獨(dú)立于染色體外而能自我復(fù)制的遺傳物質(zhì)，一般為雙鏈的共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA。 “322”表示實(shí)驗(yàn)編號(hào)。 1．具有復(fù)制起點(diǎn) 2．具有抗菌素抗性基因 3．具有若干限制酶單一識(shí)別位點(diǎn) 4．具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù) 四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素 抗性基因O r i P s t Ⅰ S a l ⅠP v u ⅡA v a ⅠB a m H ⅠH in d ⅢE c o R Ⅰp B R 32 2( a m pr)( t e rr)pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)： 具有較小的分子量； 它的分子量為 4363bp。 具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。其中 7種內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部， 2種識(shí)別位點(diǎn)在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，所以 9個(gè)限制酶切位點(diǎn)插入外源片斷可以導(dǎo)致 tetr 基因的失活；另外有 3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識(shí)別位點(diǎn)， 具有較高的拷貝數(shù) ,經(jīng)過(guò)氯霉素?cái)U(kuò)增后 ,每個(gè)細(xì)胞中可積累 10003000拷貝。 ? 與 pBR322質(zhì)粒載體相比， pUC系列的優(yōu)點(diǎn)有如下三方面。 ? ②適用于組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體。 a互補(bǔ) ? 載體的來(lái)自 E． coli的 Lac操