【正文】 下式表示： R （ NH2— CH— COOH） 一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基縮合失去一分子水，形成酰胺鍵，這種氨基酸之間連接的酰胺鍵又稱(chēng)為肽鍵，一般由三個(gè)或三個(gè)以上的氨基酸殘基組成的肽稱(chēng)為多肽。蛋白質(zhì)的肽鏈結(jié)構(gòu)成為蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，它包括氨基酸組成、肽鏈數(shù)目、末端組成、氨基酸排列順序和二硫鍵位置等。如 α 螺旋、 β 折疊和β 轉(zhuǎn)角等。 β 折疊是一種肽鏈相對(duì)伸展的結(jié)構(gòu)。環(huán)球蛋白是在三維空間中沿著多方向進(jìn)行卷曲、折疊、盤(pán)繞而成的近似球形結(jié)構(gòu)。 從共價(jià)結(jié)構(gòu)上看，亞基就是蛋白質(zhì)分子的最小共價(jià)單位。 維持四級(jí)結(jié)構(gòu)的主要力靠疏水鍵。 在特殊環(huán)境條件下 ， 某些具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子之間 ， 一種蛋白質(zhì)分子的亞基可以與另一種蛋白質(zhì)的亞基聚合 ， 并產(chǎn)生有活性的雜交分子 。 一般來(lái)說(shuō) ， 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系包含著兩個(gè)方面的問(wèn)題： ① 蛋白質(zhì)必須具備特定的結(jié)構(gòu) ， 才能表現(xiàn)特定的功能 ， 在蛋白質(zhì)肽鏈中有一些基團(tuán)對(duì)特定功能而言是必需基團(tuán) ， 另一些是非必需基團(tuán)；② 在體內(nèi) ， 蛋白質(zhì)分子是如何利用它的特定結(jié)構(gòu)執(zhí)行特定的生物功能的 。 1972年 ， 美國(guó)斯坦福大學(xué) Berg成功實(shí)現(xiàn)了 DNA重組實(shí)驗(yàn) ， 從此揭開(kāi)了基因工程發(fā)展的序幕 ， 并逐步形成了以基因工程為核心內(nèi)容 ，包括細(xì)胞工程 、 酶工程 、 發(fā)酵工程在內(nèi)的一系列高新生物技術(shù) 。這是新一代的基因工程，因而蛋白質(zhì)工程也稱(chēng)為第二代基因工程。 蛋白質(zhì)工程的出現(xiàn)是生物技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)階段的必然產(chǎn)物 ， 同時(shí)也是社會(huì)生產(chǎn)實(shí)踐和生物科學(xué)研究的客觀需要 。同時(shí)計(jì)算機(jī)輔助處理系統(tǒng)可以通過(guò)生物物理學(xué)原理 ， 模擬預(yù)測(cè)氨基酸序列的變化對(duì)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的影響 。 有關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究的理論和技術(shù)； 如準(zhǔn)確地由一級(jí)機(jī)構(gòu)推測(cè)高級(jí)機(jī)構(gòu)、肽鏈折疊的精確控制，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可變性，分子動(dòng)力學(xué)與蛋白質(zhì)功能的關(guān)系，蛋白質(zhì)在晶體、液體以及細(xì)胞中的不同存在狀態(tài)及其對(duì)蛋白質(zhì)性質(zhì)、功能的影響等等。 167。 ? 在深入了解某一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)有目標(biāo)的、嚴(yán)格的分子設(shè)計(jì)，定向地改造或構(gòu)建一個(gè)具有特定性質(zhì)和功能的目的蛋白質(zhì)。 核磁共振可以直接對(duì)水溶液中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，溶液中的空間構(gòu)象更接近于生物體中的自然狀態(tài)，更能反映蛋白質(zhì)在執(zhí)行功能時(shí)的實(shí)際構(gòu)象狀態(tài)。 167。 1985年，美國(guó)的埃斯特爾借助 PCR技術(shù)，用 19種其他氨基酸分別替換枯草芽孢桿菌蛋白酶分子第 222位殘基上容易受氧化的蛋氨酸，獲得了一系列活性差異很大的突變酶。這種酶有兩個(gè)相同的亞基，每個(gè)亞基含有兩個(gè)天門(mén)冬酰胺，它們都位于亞基之間的界面上，對(duì)酶的熱穩(wěn)定性起決定性作用。改變食品級(jí)酶的最適 pH值條件，使酶適應(yīng)食品加工環(huán)境，在工藝控制上非常重要。借助定點(diǎn)突變技術(shù)，研究人員確定了嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)生的新支鏈淀粉酶的活性中心。 ? 蛋白質(zhì)工程的組成部分。 41酶工程原理和方法 酶是由生物體產(chǎn)生的具有催化劑活性的蛋白質(zhì) 。 酶工程： 酶是基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程和生化工程的研究對(duì)象和工具。 其中固定化酶技術(shù)是酶工程的核心。 ? –提取法 ? 采用各種提取、分離技術(shù)從動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞或組織中將酶提取分離出來(lái)。 ? 例如，從動(dòng)物胰臟中提取胰酶；從動(dòng)物胃中提取胃蛋白酶等 。 – 化學(xué)合成法 ? 現(xiàn)在已可用肽合成儀來(lái)進(jìn)行酶的化學(xué)合成。 ? 一、菌種的活化和擴(kuò)大培養(yǎng) ? (一 )菌種活化 ? (二 )菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) ? 二、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備 ? 1．碳源，碳源是指能向細(xì)胞提供碳素的含碳化合物。無(wú)機(jī)氮包括各種銨鹽和硝酸鹽等。誘導(dǎo)物多為底物或底物類(lèi)似物，如淀粉、蔗糖、纖維素分別是淀粉酶、蔗糖酶、纖維素酶的誘導(dǎo)物。 ? ④縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率，在利用固定化細(xì)胞發(fā)酵時(shí)，第二批次及以后批次的發(fā)酵周期縮短。 ? (三 )溶解氧 ? 在發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)連續(xù)不斷地供給無(wú)菌空氣，同時(shí)進(jìn)行攪拌以增加培養(yǎng)基中溶解氧的含量。 ? ②除去出發(fā)酶液中的懸浮固形物．獲得澄清的酶液。 保藏菌種 ?活化 ?擴(kuò)培 ?發(fā)酵 ?分離純化 ?成品 (酶 ) 固體發(fā)酵 液體發(fā)酵 一般工藝流程： ? 1．溫度操作過(guò)程盡可能在低溫 (０ ― ４ ℃ )下進(jìn)行，溶液中存在無(wú)機(jī)鹽或有機(jī)溶劑時(shí)，更應(yīng)如此，以防止蛋白質(zhì)水解酶對(duì)目的酶的分解破壞。 ? ④將獲得的沉淀干燥，研磨成粉，加入適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑、填充劑等，做成粉末制劑。 43 酶的分離純化 ? ? ①首先獲得出發(fā)酶液。 (二 )pH值 ? 不同的微生物所需要的最適 pH不同。例如，枯草桿菌堿性磷酸酶的合成受其催化產(chǎn)物無(wú)機(jī)磷酸的抑制 ? ① 產(chǎn)酶效率高 ，細(xì)胞被固定化后，只能在一定的空間范圍內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，細(xì)胞密度增大，故可加快生化反應(yīng)速度，提高產(chǎn)酶率。 ? 4．生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)因子是指細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所必需的微量有機(jī)物質(zhì)，包括維生素、氨基酸、嘧啶、嘌呤等，它們是構(gòu)成輔酶的必需物質(zhì)。氮源分為有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮。 ?酶的生產(chǎn)方法 ? –酶的產(chǎn)量高 –容易培養(yǎng)和管理 –產(chǎn)酶穩(wěn)定性好 –利于酶的分離純化 –安全可靠 ? ： –菌種保存機(jī)構(gòu) –篩選 ?菌種采集 ?菌種的分離、純化 ?菌種生產(chǎn)性能的檢定 –初篩：從已分離的菌種中挑出可產(chǎn)生目的酶的菌株。 42 酶的生物發(fā)酵生產(chǎn) – 發(fā)酵法 ? 利用細(xì)胞，主要是微生物細(xì)胞的生命活動(dòng)而獲得所需的酶。目前在動(dòng)、植物資源豐富的地區(qū)，仍有使用價(jià)值。 生命活動(dòng)過(guò)程中的新陳代謝所涉及的各種 化學(xué)反應(yīng)由各種酶的催化來(lái)實(shí)現(xiàn)。 酶工程 化學(xué)酶工程 生物酶工程 自然酶 化學(xué)修飾酶 固定化酶 人工合成酶 克隆酶 突變酶 新酶 ? (一 )反應(yīng)條件溫和 ? (二 )催化效率高 ? (三 )反應(yīng)專(zhuān)一性強(qiáng) ? (四 )反應(yīng)可調(diào)節(jié)控制 一、產(chǎn)酶菌種的選育和保藏 ? （一）常用產(chǎn)酶微生物 ? (二 )菌種的分離篩選 ? 1．優(yōu)良菌種的特點(diǎn) ? 一個(gè)優(yōu)良菌種應(yīng)具備以下幾個(gè)條件：①繁殖快，產(chǎn)酶量高，生產(chǎn)周期短；②適應(yīng)性強(qiáng)，容易培養(yǎng)和控制，便于管理和降低生產(chǎn)成本；③產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，不易退化，不易受噬菌體侵襲；④產(chǎn)生的酶容易分離純化；⑤菌種本身和代謝產(chǎn)物安全無(wú)毒，對(duì)生產(chǎn)人員、生產(chǎn)環(huán)境，酶的應(yīng)用不會(huì)產(chǎn)生不良影響。 ? 高效率 比非催化高 108－ 1020倍 比非酶催化高 107－ 1013倍 ? 高度專(zhuān)一性 ? 反應(yīng)條件溫和 ? 酶催化是可調(diào)控的 ? 酶工程 ? (enzyme engineering)即利用酶的催化作用，在一定的生物反應(yīng)器中，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成所需的產(chǎn)品。 ? 定點(diǎn)突變技術(shù)。 修飾 Nisin的生物防腐效應(yīng) (Nisin)乳酸鏈球菌素，是一種乳酸鏈球菌在代謝過(guò)程中合成和分泌的有較強(qiáng)抑菌作用的小分子肽，是目前研究最多，應(yīng)用最廣，由乳酸菌產(chǎn)生的唯一能應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)的細(xì)菌素。 提高酶的催化特性 研究人員對(duì)嗜熱脂肪芽孢桿菌的（蘇氨酸） TyrtRNA合成酶進(jìn)行定位突變后，改變了其與底物結(jié)合的特異性，從而提高了催化效率。 通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì) 中非必需的天門(mén)冬酰胺進(jìn)行突變，有利于提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。 蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)研究表明， T4溶菌酶分子由一條肽鏈構(gòu)成，并在空間上折疊形成兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的單元，酶活性中心位于兩個(gè)單元之間，該酶分子的一個(gè)重要特性是在第 97位和第 54位殘基上是兩個(gè)未形成二硫鍵的半胱氨酸，所以野生性的溶菌酶是不含二硫鍵的蛋白質(zhì)分子。 一般來(lái)說(shuō)提高蛋白的穩(wěn)定性包括以下幾個(gè)方面：①延長(zhǎng)酶的半衰期；②提高酶的熱穩(wěn)定性；③延長(zhǎng)藥用蛋白質(zhì)的保存期；④抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失。 ? 成核作用是由于擠壓效應(yīng)或疏水作用，多肽鏈中的一些小肽段迅速形成螺旋性的核心區(qū)； ? 折卷則是已成核的結(jié)構(gòu)散落成為較大的超二級(jí)結(jié)構(gòu)單元的集合體； ? 凝集則是集合體在原子水平凝集，形成致密的三級(jí)結(jié)構(gòu)。 33蛋白質(zhì)工程的研究方法 ? 結(jié)構(gòu)分析方法 ? 蛋白質(zhì)的分離純化鑒定方法 ? 功能研究方法 ? 進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造的分子生物學(xué)研究方法 ? 與研究蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)的理論與技術(shù) ? 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析方法 ? 蛋白質(zhì)構(gòu)象研究方法 ? 蛋白質(zhì)折疊過(guò)程研究方法 ? 蛋白質(zhì)生物物理研究方法及計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)模擬研究 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)研究，既氨基酸序列的測(cè)定，其原理是片段重疊、逐級(jí)降解、 cDNA以質(zhì)譜法等幾種，其中片段重疊和逐級(jí)降解是最常用的方法。 ? 利用目的基因表型具有高效檢測(cè)篩選系統(tǒng)這一特性，在目標(biāo)條件下從隨機(jī)誘變基因庫(kù)中分離出目標(biāo)基因，最終獲得突變蛋白質(zhì)。 盡管蛋白質(zhì)工程相關(guān)技術(shù)還很不成熟，但是這一生物技術(shù)已經(jīng)取得了令人矚目的成就，特別是在酶制劑的性質(zhì)改良方面，取得了突破性進(jìn)展。 通過(guò)這一過(guò)程的重復(fù)進(jìn)行 ，最終符合目的蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu) 、 性質(zhì)和功能設(shè)計(jì)的要求 。主要包括以下兩大方面：分子遺傳學(xué)的相關(guān)理論與技術(shù)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的相關(guān)的理論與技術(shù)。 嚴(yán)格地說(shuō)蛋白質(zhì)工程就是以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究為基礎(chǔ)，運(yùn)用遺傳工程的方法，借助計(jì)算機(jī)信息處理技術(shù)的支持，從改變和合成基因入手，定向地改造天然蛋白質(zhì)或設(shè)計(jì)全新的人工蛋白質(zhì)分子，使之具有特定的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，能更好地為人類(lèi)服務(wù)的一種生物技術(shù)。 這些技術(shù)的融合 ， 促使了蛋白質(zhì)工程這一新興生物技術(shù)領(lǐng)域的誕生 ， 為認(rèn)識(shí)和改造蛋白質(zhì)分子提供了強(qiáng)有力的手段 。這種張力也是依靠酶分子中的許多非活性中心部位的協(xié)調(diào)作用而發(fā)生的。 不少多肽和蛋白質(zhì)分子，不論其是否由亞基組成，都能聚合成聚合物。構(gòu)成四級(jí)結(jié)構(gòu)的原體可排列成二聚體、三聚體、四聚體、五聚體，最多可聚合成六十聚體等。由亞基聚合而成的蛋白質(zhì)分子稱(chēng)為寡聚蛋白。 維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力有四種共價(jià)鍵類(lèi)型： ① R基之間的氫鍵； ② 非極性 R基之間的疏水基相互作用 （ 范德華引力 ） ； ③ α 螺旋和 β 折疊中的肽鏈內(nèi)或肽鏈間德氫鍵；④ 帶正負(fù)電荷的 R基之間的離子鍵 。在天然蛋白質(zhì)變性時(shí)，往往就包含 α 螺旋向β 折疊的轉(zhuǎn)變。二級(jí)結(jié)構(gòu)不涉及氨基酸殘基的側(cè)鏈構(gòu)象。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是最基本的，它包含著決定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵性因素。蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象又稱(chēng)為空間結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)、立體結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)等等，是指蛋白質(zhì)分子中所有原子在三維空間的擺布情況規(guī)律。 shi和胨僅用于表示分子量較大但不確定的多肽混合物 。 31蛋白結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和蛋白質(zhì)工程的原理 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本構(gòu)件 在自然界中，構(gòu)成生命最基本的物質(zhì)有蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂類(lèi)等生物大分子，其中蛋白質(zhì)最為重要，核酸則最為根本。 ? （ 5）篩選與培育，即基因表達(dá)產(chǎn)物的鑒定、收集和加工等一系列復(fù)雜過(guò)程的綜合。 ? (3)重組 DNA，即用人工方法，讓目的基因與運(yùn)載體相結(jié)合，首先要用限制性?xún)?nèi)切酶和其他一些酶類(lèi)，切割或修飾載體 DNA和目的基因，然后用連接酶將兩者連接起來(lái)，使目的基因插入載體內(nèi)，形成重組 DNA分子。獲取目的基因是基因工程操作的關(guān)鍵。 ?人類(lèi)基因組計(jì)劃 ? 基因工程是一項(xiàng)非常復(fù)雜的技術(shù)操作，它的環(huán)節(jié)之繁多、操作之細(xì)致是其他工程所無(wú)法比擬的。 五、目的基因翻譯產(chǎn)物檢測(cè) ? 最常用的是蛋白質(zhì)印跡 (Westernblotting)法。因此，當(dāng) RNA探針及待測(cè) DNA的混合物置于這種退火條件下， RNA便會(huì)同它的購(gòu) DNA分子中的互補(bǔ)序列退火形成穩(wěn)定的 DNA—RNA雜交分子，而使被取代的 DNA鏈處于單鏈狀態(tài)。經(jīng)多種限制性?xún)?nèi)切酶切割分析，若兩種結(jié)果都一樣，可認(rèn)為克隆子中克隆的是原定的目的基因，其核苷酸序列沒(méi)有變化。如果被檢測(cè) DNA片段與核酸探針具有互補(bǔ)序列，就能在被檢測(cè) DNA的條帶部位結(jié)合成雙鏈的雜交分子，并通過(guò)放射自顯影顯示出黑色條帶來(lái)。 (二 )核酸雜交法 2．斑點(diǎn)印跡雜交 ? 斑點(diǎn)印跡雜交法與菌落印跡原位雜交的原理一樣，但方法更簡(jiǎn)單、迅速，可直接將噬菌體的上清液或是由轉(zhuǎn)化子提取的DNA(RNA)樣品直接點(diǎn)在硝酸纖維素濾膜等固體支持物上，然后同核酸探針進(jìn)行分子雜交。將影印的硝酸纖維素濾膜，用堿液處理，促使細(xì)菌細(xì)胞壁原位裂解、釋放出 DNA并隨之原位變性。即將目的基因重組體通過(guò)顯微注射裝置直接注入細(xì)胞核中。經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜融合，細(xì)菌內(nèi)容物轉(zhuǎn)入動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中，質(zhì)粒DNA被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。這是將外源基因?qū)氩溉轭?lèi)細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的常規(guī)方法。用電