【正文】 ? ③ 利用各種技術(shù)將酶沉淀分離。 ? ⑤酶容易分離純化，固定化細(xì)胞顆粒很容易與發(fā)酵液分離，發(fā)酵液中游離細(xì)胞很少，因此有利于酶的分離純化 ? (一 )溫度 ? 不同的微生物生長有不同的最適溫度，例如黑曲霉的最適溫度為 28～ 32℃ ，枯草桿菌最適溫度是 34—37℃ 。 ? 3．無機(jī)鹽類無機(jī)鹽提供細(xì)胞生命活動(dòng)必需的無機(jī)元素，對(duì)培養(yǎng)基的 pH、緩沖能力和滲透壓起調(diào)節(jié)作用。 ? 合成成本高昂，且只能合成已知化學(xué)結(jié)構(gòu)的酶。是最早采用的酶生產(chǎn)技術(shù)。 酶工程的研究可以促進(jìn)基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程和生化工程的發(fā)展。 ? 蛋白質(zhì)工程的主要研究方法。 葡萄糖異構(gòu)酶（ GI）能將 D－葡萄糖、 D－木糖和 D－核糖等催化為相應(yīng)的酮糖；在體外一定條件下，它也能催化 D－葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖，因而成為工業(yè)上制備高果糖漿的關(guān)鍵酶；它還用于含木聚糖類物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，是一種具有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值得工業(yè)用酶。 蠟狀芽孢桿菌 梭狀芽孢桿菌1 引入二硫鍵，改善蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性 溶菌酶是一種廣泛用于食品工業(yè)的酶制品，其催化速率隨溫度升高而升高，因此，這種工業(yè)用酶的熱穩(wěn)定性是提高其應(yīng)用潛力的重要標(biāo)準(zhǔn)。 蛋白質(zhì)折疊過程研究方法 ? 目前流行的蛋白質(zhì)折疊過程理論是Amfinsen提出的隨機(jī)成核理論：即線性多肽鏈折疊呈現(xiàn)“成核 折卷 凝集”三個(gè)階段。 ? 一是對(duì)天然蛋白質(zhì)的改造，包括小改、中改以及大改； ? 二是完全重新構(gòu)建一個(gè)自然界中沒有的全新的蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)可以按改造部位的多寡分為三類 ? 第一類為“小改” ? 第二類為“中改” ? 第三類為“大改” 167。 有關(guān)一些相關(guān)技術(shù) ： 如微量蛋白質(zhì)的純化鑒定技術(shù)、更有效的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法、計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)的有效性等。 蛋白質(zhì)工程是在現(xiàn)代生物學(xué)理論和技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上誕生的，同時(shí)也是借助于其他許多學(xué)科相互滲透、相互作用而發(fā)展的。 20世紀(jì) 80年代初 ， 隨著蛋白質(zhì)晶體學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展 ， 人類可以通過對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的了解 ， 借助計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì) ， 利用基因定位誘變等高新技術(shù)改造基因 ， 以達(dá)到改進(jìn)蛋白質(zhì)某些性質(zhì)的目的 。 這一過程也是一種分子雜交 。亞基一般是由一條多肽鏈組成的，但有的亞基也可以由幾條多肽鏈組成，這些多肽鏈通常以二硫鍵相連接稱為亞基。在這種結(jié)構(gòu)模型中，肽鏈按層排列，在相鄰的肽鏈之間形成氫鍵，得以鞏固這種結(jié)構(gòu)。 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)就是由許多氨基酸序列按照一定的排列順序，通過肽鍵相連接而成的多肽鏈結(jié)構(gòu)，每一種蛋白質(zhì)的肽鏈的氨基酸都有一定的排列順序。 蛋白質(zhì)的生理功能 蛋白質(zhì)是一切生命活動(dòng)的體現(xiàn)者： 構(gòu)成細(xì)胞和生物體的主要成分 調(diào)節(jié)作用：酶，部分激素（如胰島素、生長激素） 運(yùn)輸作用：如血紅蛋白、載體、肌紅蛋白（貯氧） 免疫作用：如抗體 運(yùn)動(dòng)作用：如肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白 凝血：如纖維蛋白 蛋白質(zhì)經(jīng)干燥后 ， 其元素組成平均值約為： 碳： 50—55％ ；氫： —％ ； 氧： 20—23％ ；氮： 15—17％ ； 硫： ％ 分子量： 10， 000—1， 000， 000道爾頓 化學(xué)組成 生產(chǎn)上常把蛋白質(zhì)不完全水解的產(chǎn)物按分子大小分別稱為 shi、 胨 、 肽 。 ? （ 4）把重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，即用人工方法，讓攜帶著目的基因的運(yùn)載體進(jìn)入新的生物細(xì)胞里，讓其增殖，由此形成重組 DNA的無性生殖系（即克隆）。那里面含有一種或幾種遺傳信息的全套遺傳密碼。根據(jù)轉(zhuǎn)錄的 RNA在一定條件下可以同轉(zhuǎn)錄該種 RNA的模板 DNA鏈進(jìn)行雜交的特性，制備目的基因 DNA探針，變性后同克隆子總RNA雜交，若出現(xiàn)明顯的雜交信號(hào)，可以認(rèn)定進(jìn)入受體細(xì)胞的目的基因轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的 mRNA。 ? 用限制性內(nèi)切酶對(duì)待克隆的目的基因和已克隆的目的基因進(jìn)行切割，若凝膠電泳結(jié)果不一致，可斷定克隆子中克隆的不是目的基因，或者克隆的目的基因的核苷酸序列已發(fā)生了變化。含有同探針序列同源的DNA的印跡，在 x光底片上呈現(xiàn)黑色的斑點(diǎn)，將膠片同原先保存的參照平板進(jìn)行對(duì)照，即可確定陽性菌落或噬菌斑的位置，從而獲得含有目的基因插入片段的重組礎(chǔ)工業(yè)體克隆。 ? 7．細(xì)胞核的顯微注射法。 導(dǎo)入方法 ? 4．磷酸鈣或 DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。 (b)制備受體細(xì)胞的整個(gè)過程要在０～ 4℃ 進(jìn)行，并盡量避免污染。 ? 4．磷酸鈣或 DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。于是便可以按照常規(guī)的粘性末端連接法，將待克隆的 DNA片段同載體分子連接起來 平末端連接 （ 4） DNA接頭連接法 ? DNA銜接物連接法盡管有諸多方面的優(yōu)越性，但也有一個(gè)明顯的缺點(diǎn)，那就是如果待克隆的 DNA片段或基因的內(nèi)部，也含有與所加的銜接物相同的限制位點(diǎn)，這樣在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也就會(huì)把克隆基因切成不同的片段，從而為后繼的亞克隆及其它操作造成麻煩。 ? 同聚物加尾法的 不足 之處：①方法煩瑣；②外源片段難以回收。 （ 1）直接用 T4DNA連接酶連接 平末端連接 （ 1） T4DNA連接酶除了能夠封閉具有 3， 一OH和 5’一 P末端的雙鏈 DNA的缺口之外，在存在 ATP和加入高濃度酶（ 10100倍） 和低濃度的聚乙二醇 PEG8000存在的條件下，它還能夠連接具有完全堿基配對(duì)的平末端的DNA分子。 ? 5． cDNA的甲基化和接頭的加入 ? 6．雙鏈 cDNA與載體的連接 第一條互補(bǔ) DNA鏈的合成需要 RNA模板、cDNA合成引物、反轉(zhuǎn)錄酶、 4種脫氧核苷三磷酸以及相應(yīng)的緩沖液 (Mg2+)等。 鳥槍法 (shot gun) ? 這一方法又叫霰彈法。 固相支持物：①硝酸纖維素濾膜 ②尼龍膜 分類： ①涉及 DNA吸印的 southern吸印雜交法 ②涉及 RNA吸印的 northern吸印雜交法 吸印方法：①虹吸轉(zhuǎn)移法 ②電泳轉(zhuǎn)移法 ③真空轉(zhuǎn)移法 膜上吸印雜交 概念 ? southern吸印雜交法 通過虹吸轉(zhuǎn)移法、電泳轉(zhuǎn)移法、真空轉(zhuǎn)移法等轉(zhuǎn)移方法將經(jīng)電泳分離及變性的 DNA片段轉(zhuǎn)移到一定固相支持物上然后進(jìn)行雜交并對(duì)其實(shí)行檢測的方法 ? northern吸印雜交法 通過虹吸轉(zhuǎn)移法、電泳轉(zhuǎn)移法、真空轉(zhuǎn)移法等轉(zhuǎn)移方法將經(jīng)電泳分離及變性的 RNA片段轉(zhuǎn)移到一定固相支持物上然后進(jìn)行雜交并對(duì)其實(shí)行檢測的方法 Southern 雜交 PCR技術(shù)是指在模板 DNA、引物和 4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，利用 DNA聚合酶催化合成反應(yīng)，體外擴(kuò)增特異 DNA片段的技術(shù)。 柯斯質(zhì)粒的特點(diǎn)大體上可歸納成如下 4個(gè)方面。 噬菌體載體 ? λ噬菌體載體 ? M13噬菌體載體 ? 噬菌粒載體 噬菌體載體 柯斯質(zhì)粒載體 ? 也稱黏粒載體，是指一類由人工構(gòu)建的含有 λDNA的 cos位點(diǎn)和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體 ? λ噬菌體基因組是一長度為 48 502bp的線性雙鏈 DNA分子，其末端為長 12個(gè)核苷酸的互補(bǔ)單鏈，稱為粘端 (cohesive end， cos)。當(dāng)培養(yǎng)基中含有 IPTG時(shí)，細(xì)胞可同時(shí)合成這二個(gè)功能上互補(bǔ)的片段，使含有此種質(zhì)粒上述受體菌在含有生色底物 5—溴 —4—氯 —3—吲哚 —β—D—半乳糖苷 (X—gal)的培養(yǎng)基上形成藍(lán)色菌落。其中 7種內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部， 2種識(shí)別位點(diǎn)在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，所以 9個(gè)限制酶切位點(diǎn)插入外源片斷可以導(dǎo)致 tetr 基因的失活；另外有 3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識(shí)別位點(diǎn)， 具有較高的拷貝數(shù) ,經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增后 ,每個(gè)細(xì)胞中可積累 10003000拷貝。可以分為： ? 大腸桿菌載體 ? 植物載體 ? 酵母載體 ? 動(dòng)物載體 基因克隆載體分類 大腸桿菌載體 ? 質(zhì)粒載體 ? 噬菌體載體 ? 柯斯質(zhì)粒載體 將外源 DNA導(dǎo)入原核生物細(xì)胞 質(zhì)粒載體 質(zhì)粒（ plasmid）是指細(xì)菌等生物細(xì)胞內(nèi)一類獨(dú)立于染色體外而能自我復(fù)制的遺傳物質(zhì)，一般為雙鏈的共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA。 ? 外切酶的活性比 Klenow酶強(qiáng) 200倍，并且在高濃度的 dNTP存在時(shí)，降解作用即會(huì)停止 ? ②進(jìn)行雙鏈 DNA的 3’末端標(biāo)記。p之間形成磷酸二酯鍵，從而將具黏性末端的雙鏈 DNA、平末端雙鏈 DNA以及帶缺口的雙鏈 DNA連接起來。 切割頻率： 某限制酶在該 DNA切割位點(diǎn)出現(xiàn)頻率 Ⅱ 型 限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 識(shí)別序列 ? 可識(shí)別長度為 47bp的雙鏈 DNA特定序列，該識(shí)別序列（識(shí)別位點(diǎn)）常呈旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性。 ? 1961年 Nirenberg， 1965年 Holley， 1967年 Khorana分別對(duì) 20種常見氨基酸以及起始和終止密碼完成了破譯。由于發(fā)酵多與微生物密切聯(lián)系在一起 ， 所以又有微生物工程或微生物發(fā)酵工程之稱 。 20世紀(jì) 50年代 ? 氨基酸發(fā)酵工業(yè)成為生物工程的一個(gè)新成員 20世紀(jì) 60年代 ? 酶制劑工業(yè)的出現(xiàn) 20世紀(jì)末、 21世紀(jì)初 人類基因組測序酵母基因組測序、水稻基因組測序先后基本或全部完成，使生物技術(shù)發(fā)生了巨大的革命，逐步形成了以基因工程為核心的現(xiàn)代生物技術(shù) 生物工程定義的充實(shí) ? 1917：利用生物將原材料轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品 ? 1982：應(yīng)用自然科學(xué)及工程學(xué)的原理，依靠微生物、動(dòng)物、植物作為反應(yīng)器，將物料進(jìn)行加工以提供產(chǎn)品來為社會(huì)服務(wù)的技術(shù) ?生物工程的定義： 人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的，即現(xiàn)代生物工程技術(shù)。 細(xì)胞工程 ? 細(xì)胞工程 (cell engineering)是指以細(xì)胞為基本單位 ， 在體外條件下進(jìn)行培養(yǎng) 、 繁殖或人為地使細(xì)胞某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改 變 ， 從而達(dá)到改良生物品種和創(chuàng)造新品種的目的 ， 加速繁育動(dòng)植物個(gè)體 ， 或獲 得某種有用物質(zhì)的技術(shù) 。 ? 現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展 ? 現(xiàn)代生物技術(shù)時(shí)期是以分子生物學(xué)的理論為先導(dǎo)，以 20世紀(jì) 70年代 DNA重組技術(shù)的建立為標(biāo)志的。 ⑥ 基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代 基因工程研究的理論依據(jù) ① 不同的基因有相同的物質(zhì)基礎(chǔ) ② 基因是可切割的 ③ 基因是可轉(zhuǎn)移的 ④ 多肽與基因之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系 ⑤ 遺傳密碼是通用的 基因工程技術(shù)路線 DNA片段的取得（目的基因的分離和制備） DNA片段和載體的連接 ——重組體 DNA 外源 DNA片段引入受體細(xì)胞 ——基因克隆和基因文庫 選擇基因（目的基因） 目的基因表達(dá) 切 接 轉(zhuǎn) 選 表達(dá) 限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶 DNA連接酶 基因的剪刀 基因的針線 ? 一類能夠識(shí)別和切割雙鏈 DNA分子內(nèi)核苷酸序列的內(nèi)切核酸酶。 ? 最常見的是 T4噬菌體 DNA連接酶 ? DNA連接酶 能夠催化 DNA鏈上彼此相鄰的3’羥基（ OH ）和 5’磷酸基團(tuán)（ P），形成磷酸二酯鍵。 ? ④ DNA序列測定。 ? 具有能夠直接觀察的表型特征 基因克隆載體具備條件 ? 克隆載體必須是安全的?？寺≥d體的分子量大小不要超過 10kb。 ? ③具有多克隆位點(diǎn) MCS區(qū)段 MCS可以使兩種不同黏性末端的外源 DNA片段，無需借助其它操作而直接克隆到 pUC質(zhì)粒載體上。 噬菌體載體 ? 噬菌體的生命周期分為溶菌周期和溶源周期?？刹迦腴L度約為 20kb的外源 DNA。 核酸分子探針的標(biāo)記 ? 切刻平移法 ? 隨機(jī)引物法 ? 末端標(biāo)記法 ? 隨機(jī)引物是指含有各種可能排列順序的寡聚核苷酸片斷的混合物。這樣，人們可以通過控制熔解使富 A=T區(qū)解鏈變性，而富 G≡C區(qū)仍維持雙鏈。 ? cDNA文庫法 ? 以適當(dāng)?shù)哪康幕蚱巫魈结?，利用高密度的噬菌斑或菌落原位雜交技術(shù)，從大量的噬菌斑或菌落中篩選出含有目的基因的重組體的噬菌