【正文】 使之磷酸化，然后再通過 T4DNA連接酶的作用使兩者連接起來。②因為載體和外源片段的末端是互補的黏性末端，所以連接效率較高。切下的目的基因的片段插入到質(zhì)粒的切口處，再加入適量的 DNA連接酶，質(zhì)粒的黏性末端與目的基因 DNA片段的黏性末端就會因堿基互補配對而結(jié)合，形成一個重組DNA分子。 ? cDNA文庫法 cDNA文庫的建立方法 ? 1．分離表達目的基因的組織或細胞 ? 2．從組織和細胞中制備總體 RNA和 mRNA ? 3．第一條 cDNA鏈的合成 ? 4．第二條 cDNA鏈的合成 ? (i)自身引導(dǎo)法 (圖 115) ? (ii)cDNA第二條鏈的置換合成法 (圖 141)。當利用單鏈核酸酶 s1酶去除解開的單鏈部分，得到富 G≡C區(qū)的 DNA片段。 ? 隨機引物法是近年發(fā)展起來的一種較理想的核酸探針的標記方法。在可取代的區(qū)段中帶有 lacZ基因的相應(yīng)序列時， λ重組體亦可用 β半乳糖苷酶失活法進行篩選。 ? 只具有溶菌生長周期的噬菌體顆粒叫烈性噬菌體。 a互補 ? 載體的來自 E． coli的 Lac操縱子的 DNA區(qū)段，編碼 β—半乳糖苷酶氨基端的一個片段。 具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。 ? 易于從宿主細胞中分離，并進行純化。 T4DNA聚合酶 ? 這是由 T4噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物純化而來，具有兩種酶催活性，即 5’→3’ 的聚合酶活性和 3’→5’ 的核酸外切酶活性。 DNA連接酶 ? DNA連接酶就可以用來在體外連接 DNA片段 ? DNA連接酶的作用 ? 是將雙螺旋 DNA分子的某一條鏈上兩個相鄰核苷酸之失去一個磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈缺口封閉起來，即催化 339。 ? restriction endonuclease ? 這類酶又簡稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶 。 ? 1944年美國微生物學家 Avery等用實驗證明了 DNA是遺傳信息的攜帶者。細胞工程主要包括動植物細胞的體外培養(yǎng)技術(shù) 、 細胞 融合技術(shù) (也稱細胞雜交技術(shù) )、 細胞器移植技術(shù)等 。生物工程概論 動物科技學院 第一章 緒論 第一節(jié) 生物工程的概述 ? 生物工程的產(chǎn)生及定義 ? 生物工程的種類 1 .1生物工程的產(chǎn)生及定義 生物工程概念的提出 ? 1917年匈牙利工程師提出： 用甜菜作為飼料進行大規(guī)模養(yǎng)豬 ,及利用生物將原料轉(zhuǎn)化成為產(chǎn)品 . ? 19世紀：人類有意識的利用酵母進行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)：酒精、面包酵母、檸檬酸 ? 1928年 發(fā)現(xiàn)青霉素，同時以獲取細菌的次級代謝產(chǎn)物 ——抗生素為主要特征的抗生素工業(yè)成為當時生物技術(shù)的支柱產(chǎn)業(yè)。 發(fā)酵工程 ? 發(fā)酵工程 (fermentation engineering)是指利用包括工程微生物在內(nèi)的某些微生物或動 、 植物細胞及其特定功能 ， 通過現(xiàn)代工程技術(shù)手段 (主要是發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器的自動化 、 高效化 、 功能多樣化 、 大型化 )生產(chǎn)各種特定的有用物質(zhì)；或者把微生物直接用于某些工業(yè)化生產(chǎn)的一種技術(shù) 。 ? 1953年美國學者 Watson和 Crick發(fā)現(xiàn)了 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)， 1958年 Crick又闡明了 DNA的半保留復(fù)制模式，從而奠定了現(xiàn)代分子生物學的基礎(chǔ)。 限制性核酸內(nèi)切酶 ? 根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割ＤＮＡ的特點，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類： Ⅰ 型酶、 Ⅱ 型酶、 Ⅲ 型酶 ? Ⅰ 型酶不適合做基因工程的工具酶 ? Ⅲ 型酶在基因工程中也不常用 ? Ⅱ 型酶是基因工程理想的工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶 Ⅱ 型 限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 識別序列和切割位點 切割方式 同尾酶和同裂酶 限制性片段長度： 經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的 DNA片段。OH和 539。 主要用途 ? ① 可將任何形式的雙鏈 DNA制備成平末端的雙鏈 DNA。 根據(jù)導(dǎo)入的受體生物。 pBR322 DNA分子中總共有 24種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識別位點。異丙基 —β—D—硫代半乳糖苷 (IPTG)可誘導(dǎo)該片段的合成，而該片段能與宿主細胞所編碼的缺陷型 β半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)互補 (a互補 )。 ? 具有溶原周期的噬菌體稱為溫和噬菌體。 柯斯質(zhì)粒載體 ? 柯斯 (cosmid)質(zhì)粒是一類由人工構(gòu)建的質(zhì)粒 —噬菌體雜合載體，它的復(fù)制子來自質(zhì)粒、 cos位點序列來自 λ噬菌體，其克隆能力為 31～ 45kb，而且能夠被包裝成為具有感染性能的噬菌體顆粒。 隨機引物的探針標記 探針的末端標記 ? 是基因工程及分子生物學領(lǐng)域中最常用的基本技術(shù)之一 ? 是基于在適宜的溫度及離子強度等條件下，具有一定同源性的兩條核苷酸單鏈可按堿基互補原則復(fù)性雜交形成雙鏈的原理建立的 ? 雜交的兩條單鏈分別是核酸探針和待測核酸 核酸分子的雜交 核酸分子雜交的分類 ? 核酸原位雜交 ? 菌落原位雜交 ? 斑點狹縫雜交 ? 膜上吸印雜交 目前最常用的一種核酸分子雜交方法 膜上吸印雜交 原理：將待測核酸序列片段通過 吸印技術(shù) 轉(zhuǎn)移結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相標記的核酸探針進行雜交并對其實行檢測的方法。海膽 rDNA基因的分離就是一例。 ? (iii)引物一銜接頭法合成雙鏈 cDNA (圖 142) 。 平末端連接 連接平末端 DNA分子的方法有 4種： （ 1）直接用 T4DNA連接酶連接； （ 2）先用 末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶 ，給平末端 DNA分子加上同聚物尾巴之后再用 DNA連接酶進行連接； （ 3）用銜接物連接平末端 DNA分子； （ 4） DNA接頭連接法。③用任何一種方法制備的 DNA片段都可以用這種方法進行連接。接著用適當?shù)南拗泼赶哂秀暯游锏?DNA分子和克隆載體分子，這樣的結(jié)果使二者都產(chǎn)生出了彼此互補的粘性末端。 ? 3．聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。 導(dǎo)入方法 ? 注意以下幾點： (a)用作受體菌的細胞在培養(yǎng)時要掌握好細胞密度，一般在 OD 600為0． 4左右為好?；钴S生長的細胞或菌絲體用消化細胞壁的酶 (如 driselase)處理變成球形體后，在適當濃度的聚乙二醇 6000(PEG一 6000)的介導(dǎo)下將外源 DNA轉(zhuǎn)化入受體細胞中。將 DNA或 RNA包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進行脂質(zhì)體與細胞膜融合將基因?qū)?。將這塊固定有 DNA印跡的濾膜干燥后，同放射性標記的特異性 DNA或 RNA探針雜交，漂洗除去多余的探針，最后經(jīng)放射自顯影檢測雜交的結(jié)果。如果待測序的目的基因比較大，測序有困難，也可用 RFLP(限制性片段長度多態(tài)性 )技術(shù)。 四、目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測 ? 用 RNA印跡 (Northern blotting)法檢測。它的基本步驟可以大致歸納如下： 小結(jié) ? （ 1）獲取目的基因，即用各種不同的方法取得人所需要的基因，也就是某些 DNA片段。從這里就可以看出工具酶的重要性，沒有它們，重組工作就寸步難行。 在體內(nèi)，蛋白質(zhì)執(zhí)行著酶催化作用，使新陳代謝能有序地進行，從而表現(xiàn)出各種生命的現(xiàn)象；通過激素的調(diào)節(jié)代謝作用，以確保動物正常的生理活動；產(chǎn)生相應(yīng)的抗體蛋白，使人和動物具有防御疾病和抵抗外界病原侵襲的免疫能力；構(gòu)建成的各種生物膜，形成生物體內(nèi)物質(zhì)和信息交流的通路和能量轉(zhuǎn)換的場所。蛋白質(zhì)的肽鏈結(jié)構(gòu)成為蛋白質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)，它包括氨基酸組成、肽鏈數(shù)目、末端組成、氨基酸排列順序和二硫鍵位置等。 β 折疊是一種肽鏈相對伸展的結(jié)構(gòu)。 從共價結(jié)構(gòu)上看，亞基就是蛋白質(zhì)分子的最小共價單位。 在特殊環(huán)境條件下 ， 某些具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子之間 ， 一種蛋白質(zhì)分子的亞基可以與另一種蛋白質(zhì)的亞基聚合 ， 并產(chǎn)生有活性的雜交分子 。 1972年 ， 美國斯坦福大學 Berg成功實現(xiàn)了 DNA重組實驗 ， 從此揭開了基因工程發(fā)展的序幕 ， 并逐步形成了以基因工程為核心內(nèi)容 ，包括細胞工程 、 酶工程 、 發(fā)酵工程在內(nèi)的一系列高新生物技術(shù) 。 蛋白質(zhì)工程的出現(xiàn)是生物技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)階段的必然產(chǎn)物 ， 同時也是社會生產(chǎn)實踐和生物科學研究的客觀需要 。 有關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究的理論和技術(shù)； 如準確地由一級機構(gòu)推測高級機構(gòu)、肽鏈折疊的精確控制，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可變性，分子動力學與蛋白質(zhì)功能的關(guān)系，蛋白質(zhì)在晶體、液體以及細胞中的不同存在狀態(tài)及其對蛋白質(zhì)性質(zhì)、功能的影響等等。 ? 在深入了解某一個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，經(jīng)過有目標的、嚴格的分子設(shè)計，定向地改造或構(gòu)建一個具有特定性質(zhì)和功能的目的蛋白質(zhì)。核磁共振可以直接對水溶液中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行分析，溶液中的空間構(gòu)象更接近于生物體中的自然狀態(tài)，更能反映蛋白質(zhì)在執(zhí)行功能時的實際構(gòu)象狀態(tài)。 1985年，美國的埃斯特爾借助 PCR技術(shù)，用 19種其他氨基酸分別替換枯草芽孢桿菌蛋白酶分子第 222位殘基上容易受氧化的蛋氨酸，獲得了一系列活性差異很大的突變酶。改變食品級酶的最適 pH值條件，使酶適應(yīng)食品加工環(huán)境，在工藝控制上非常重要。 ? 蛋白質(zhì)工程的組成部分。 酶工程： 酶是基因工程、細胞工程、發(fā)酵工程和生化工程的研究對象和工具。 ? –提取法 ? 采用各種提取、分離技術(shù)從動物、植物或微生物細胞或組織中將酶提取分離出來。 – 化學合成法 ? 現(xiàn)在已可用肽合成儀來進行酶的化學合成。無機氮包括各種銨鹽和硝酸鹽等。 ? ④縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率，在利用固定化細胞發(fā)酵時，第二批次及以后批次的發(fā)酵周期縮短。 ? ②除去出發(fā)酶液中的懸浮固形物．獲得澄清的酶液。 ? ④將獲得的沉淀干燥，研磨成粉，加入適當?shù)姆€(wěn)定劑、填充劑等，做成粉末制劑。 (二 )pH值 ? 不同的微生物所需要的最適 pH不同。 ? 4．生長因子生長因子是指細胞生長繁殖所必需的微量有機物質(zhì)，包括維生素、氨基酸、嘧啶、嘌呤等，它們是構(gòu)成輔酶的必需物質(zhì)。 ?酶的生產(chǎn)方法 ? –酶的產(chǎn)量高 –容易培養(yǎng)和管理 –產(chǎn)酶穩(wěn)定性好 –利于酶的分離純化 –安全可靠 ? ： –菌種保存機構(gòu) –篩選 ?菌種采集 ?菌種的分離、純化 ?菌種生產(chǎn)性能的檢定 –初篩：從已分離的菌種中挑出可產(chǎn)生目的酶的菌株。目前在動、植物資源豐富的地區(qū)，仍有使用價值。 酶工程 化學酶工程 生物酶工程 自然酶 化學修飾酶 固定化酶 人工合成酶 克隆酶 突變酶 新酶 ? (一 )反應(yīng)條件溫和 ? (二 )催化效率高 ? (三 )反應(yīng)專一性強 ? (四 )反應(yīng)可調(diào)節(jié)控制 一、產(chǎn)酶菌種的選育和保藏 ? （一）常用產(chǎn)酶微生物 ? (二 )菌種的分離篩選 ? 1．優(yōu)良菌種的特點 ? 一個優(yōu)良菌種應(yīng)具備以下幾個條件：①繁殖快，產(chǎn)酶量高，生產(chǎn)周期短；②適應(yīng)性強，容易培養(yǎng)和控制，便于管理和降低生產(chǎn)成本；③產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，不易退化，不易受噬菌體侵襲；④產(chǎn)生的酶容易分離純化；⑤菌種本身和代謝產(chǎn)物安全無毒，對生產(chǎn)人員、生產(chǎn)環(huán)境，酶的應(yīng)用不會產(chǎn)生不良影響。 ? 定點突變技術(shù)。 提高酶的催化特性 研究人員對嗜熱脂肪芽孢桿菌的（蘇氨酸） TyrtRNA合成酶進行定位突變后，改變了其與底物結(jié)合的特異性，從而提高了催化效率。 蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)研究表明， T4溶菌酶分子由一條肽鏈構(gòu)成，并在空間上折疊形成兩個相對獨立的單元，酶活性中心位于兩個單元之間，該酶分子的一個重要特性是在第 97位和第 54位殘基上是兩個未形成二硫鍵的半胱氨酸，所以野生性的溶菌酶是不含二硫鍵的蛋白質(zhì)分子。 ? 成核作用是由于擠壓效應(yīng)或疏水作用，多肽鏈中的一些小肽段迅速形成螺旋性的核心區(qū)； ? 折卷則是已成核的結(jié)構(gòu)散落成為較大的超二級結(jié)構(gòu)單元的集合體； ? 凝集則是集合體在原子水平凝集，形成致密的三級結(jié)構(gòu)。 33蛋白質(zhì)工程的研究方法 ? 結(jié)構(gòu)分析方法 ? 蛋白質(zhì)的分離純化鑒定方法 ? 功能研究方法 ? 進行結(jié)構(gòu)改造的分子生物學研究方法 ? 與研究蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)的理論與技術(shù) ? 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析方法 ? 蛋白質(zhì)構(gòu)象研究方法 ? 蛋白質(zhì)折疊過程研究方法 ? 蛋白質(zhì)生物物理研究方法及計算機結(jié)構(gòu)模擬研究 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)研究，既氨基酸序列的測定，其原理是片段重疊、逐級降解、 cDNA以質(zhì)譜法等幾種，其中片段重疊和逐級降解是最常用的方法。 盡管蛋白質(zhì)工程相關(guān)技術(shù)還很不成熟，但是這一生物技術(shù)已經(jīng)取得了令人矚目的成就，特別是在酶制劑的性質(zhì)改良方面，取得了突破性進展。主要包括以下兩大方面：分子遺傳學的相關(guān)理