【正文】 ? 2．從組織和細(xì)胞中制備總體 RNA和 mRNA ? 3．第一條 cDNA鏈的合成 ? 4．第二條 cDNA鏈的合成 ? (i)自身引導(dǎo)法 (圖 115) ? (ii)cDNA第二條鏈的置換合成法 (圖 141)。②因?yàn)檩d體和外源片段的末端是互補(bǔ)的黏性末端，所以連接效率較高。 ? 2．高壓電穿孔法。這種方法常用于轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞以及其它真菌細(xì)胞。然后 80℃ 下烘烤濾膜，使變性 DNA原位同硝酸纖維素濾膜形成不可逆的結(jié)合。這種由單鏈 DNA分支和雙鏈 DNARNA分支形成的“泡狀”體，叫做 R環(huán)結(jié)構(gòu)。這些工作都在生物體外進(jìn)行，所以基因工程操作又叫體外 DNA重組。 蛋白質(zhì)是由許多氨基酸按一定的排列順序通過肽鍵相連而成的多肽鏈。 維持蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)最重要的作用力是疏水鍵的相互作用 。 20世紀(jì) 60年代初 ， 隨著生物化學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展和延伸 ， 人們對(duì)生物的遺傳物質(zhì) ——DNA結(jié)構(gòu)與功能已經(jīng)有了比較清楚的認(rèn)識(shí) 。 蛋白質(zhì)工程的原理 蛋白質(zhì)工程操作中的問題 有關(guān)分子遺傳學(xué)和基因工程的問題 ； 如更有效 cDNA克隆技術(shù)，精確高效的定位突變技術(shù)，高效目的基因表達(dá)系統(tǒng)等等。 核磁共振（ NMR）法是對(duì)溶液中蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的研究。 酵母菌 啤酒酵母 改變酶的最適 pH值條件 改變工業(yè)用酶的最適 pH值是蛋白質(zhì)工程研究和實(shí)踐中的另一個(gè)重要目標(biāo)。酶工程是現(xiàn)代酶學(xué)理論與化工技術(shù)的交叉技術(shù)，它的應(yīng)用主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域。 ? 根據(jù)微生物培養(yǎng)方式的不同，分為固體培養(yǎng)法、液體深層法、固定化細(xì)胞和固定化原生質(zhì)體法等。 ? ②可進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，固定化細(xì)胞固定在載體上，不易脫落，可反復(fù)使用多次。 ? ⑤當(dāng)對(duì)酶產(chǎn)品的純度要求很高時(shí)，還需要精制。 ? 三、酶合成的促進(jìn)劑和阻遏物 ? (一 )酶合成的促進(jìn)劑 ? 在培養(yǎng)基中少量添加就明顯著增加酶產(chǎn)量的物質(zhì)，統(tǒng)稱為產(chǎn)酶促進(jìn)劑．它們大多屬于酶合成的誘導(dǎo)物、酶的穩(wěn)定劑或表面活性劑。 ? 簡單方便，但受氣候、地理環(huán)境的影響，產(chǎn)品含雜質(zhì)較多，分離純化較困難。 第四章 enzyme engineering 167。 轉(zhuǎn)化氨基酸殘基，改善蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性 研究人員對(duì)釀酒酵母的磷酸丙糖異構(gòu)酶進(jìn)行誘變改造。 蛋白質(zhì)構(gòu)象研究方法 在蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)研究方面，一種是單晶體衍射法另一種是核磁共振（ NMR）法。 以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究為基礎(chǔ) ， 掌握蛋白質(zhì)活性中心的結(jié)構(gòu) ， 了解構(gòu)成中心的各氨基酸殘基及其側(cè)鏈基團(tuán)的位置 ， 再借助計(jì)算機(jī)圖像與處理系統(tǒng)的模擬進(jìn)行分子設(shè)計(jì) ， 提出對(duì)目的蛋白質(zhì)的改建或構(gòu)建方案 ， 確定活性中心的氨基酸殘基組成 ， 并輔助設(shè)計(jì)和預(yù)測其結(jié)構(gòu)功能的變化 。 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)分子所具有的多種多樣的生物學(xué)功能是與它們特殊的和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)的 。 在自然界中，多數(shù)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)呈球狀。 短肽可以進(jìn)一步水解成氨基酸 ， 并成為蛋白質(zhì)水解的最小單位 ， 是組成蛋白質(zhì)的基本單位 。 ? （ 2）獲取基因載體。 三、物理檢測法 (一 )凝膠電泳檢測法 (二 )R環(huán)檢測法 (一 )凝膠電泳檢測法 :利用凝膠電泳檢測重組質(zhì)粒 DNA分子的大小，也可以初步證明外源目的基因片段是否已插入載體。 導(dǎo)入方法 篩選和鑒定 遺傳檢測 目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測 目的基因翻譯產(chǎn)物檢測 物理檢測法 核酸分析法 一 、 遺傳檢測 根據(jù)載體表型特征的篩選 根據(jù)插入基因遺傳性狀的篩選 抗藥性標(biāo)記 β —半乳糖苷酶 顯色反應(yīng) 二、核酸分析法 (一 ) PCR法 (二 )核酸雜交法 (三 )DNA測序法 菌落印跡原位雜交 斑點(diǎn)印跡雜交 Southern印跡雜交 (一 )PCR法 ? 根據(jù)含目的基因兩端或兩側(cè)已知核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，以待鑒定的克隆子的總 DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，若獲得特異性擴(kuò)增 DNA片段，表明待鑒定的克隆子含有目的基因。 (c)為了提高轉(zhuǎn)化率，可選用復(fù)合 CaCl2溶液如“分子克隆”一書所介紹的 FSB溶液。 平末端連接 ? DNA接頭 (adapter)連接法于 1978年由康乃爾大學(xué)吳瑞教授發(fā)明的。但平末端連接效率不高，基因操作不經(jīng)常采用。然后，將這些片段混合物隨機(jī)地重組入適當(dāng)?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化后在受體菌 (如 E． coli)中進(jìn)行擴(kuò)增，再用適當(dāng)?shù)暮Y選方法篩選出你所要的基因。 ? 2．具有質(zhì)粒載體的特性 ? 具有質(zhì)粒復(fù)制子 ，具有抗菌素抗性基因 ,也有插入失活克隆位點(diǎn)。這樣，帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌將產(chǎn)生白色菌落。 “322”表示實(shí)驗(yàn)編號(hào)。 主要用途是通過 DNA缺口平移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的 DNA探針(圖 2—2) Klenow酶的主要用途 ? ① 修補(bǔ)經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化或其他方法所形成的 5’或 3’突出末端，制備平末端。 生物工程發(fā)展的趨勢 ? 目前三個(gè)平臺(tái)： DNA重組、細(xì)胞培養(yǎng)和 DNA芯片 ? 未來將會(huì)形成的幾個(gè)新的平臺(tái) 第二章 基因工程 ? 基因工程基礎(chǔ) 內(nèi) 容 ? 基因工程研究 ? 基因工程的應(yīng)用 第一節(jié) 基因工程基礎(chǔ) ? 基因工程的定義、研究內(nèi)容 ? 基因工程的工具酶 ? 基因工程的載體 ? 基因工程中的一些主要分子生物學(xué)方法 基因工程 gene engineering ? 運(yùn)用限制性內(nèi)切核酸酶、連接酶等酶類將不同 DNA進(jìn)行體外切割、連接構(gòu)成重組DNA，再將重組 DNA經(jīng)生物介導(dǎo)或直接導(dǎo)入等轉(zhuǎn)移方法引入受體細(xì)胞進(jìn)行克隆、表達(dá)，從而改變生物遺傳性以創(chuàng)造生物新種質(zhì)，或通過大量擴(kuò)增為人類提供有用產(chǎn)品等的技術(shù)。 ? 基因工程 (gene engineering) 是指在基因水平上的操作井改變生物遺傳特性的 技術(shù)。 ? 主要包括酶的固定化技術(shù)、細(xì)胞固定化技術(shù)、酶的修飾改造技術(shù)及酶反應(yīng)器的設(shè)計(jì)技術(shù)等。 ? 同裂酶指來源不同、而識(shí)別序列和切割方式均相同的核酸內(nèi)切酶。 (二 )分子克隆中常用的其他工具酶 ? 甲基化酶 ? 末端轉(zhuǎn)移酶 ? 堿性磷酸酶 ? 逆轉(zhuǎn)錄酶 ? S1核酸酶 ? Bal31植酸酶 載體的功能 ： ? 運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 ? 為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力 ? 為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件 ? Vector，本質(zhì)是 DNA ? 攜帶外源基因進(jìn)入到受體細(xì)胞的運(yùn)載工具 基因克隆載體具備條件 ? 在克隆載體合適的位置含有允許外源 DNA片段組入的克隆位點(diǎn)，并且這樣的克隆位點(diǎn)應(yīng)盡可能的多。 ? ①具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。 λ噬菌體載體的類型 ? 1．插入型載體 ? 插入型的 λ載體又分免疫功能失活和大腸桿菌 β半乳糖苷酶失活兩種亞型。 ? 外源基因 （ Foreign gene）：插入到載體內(nèi)的非自身的 DNA片段 ? 基因化學(xué)合成法 ? 基因生物制備法 DNA自動(dòng)合成儀 ? cDNA文庫法 ? PCR法 ? 基因組文庫法 ? 基因分離的物理化學(xué)方法 ? 鳥槍法 (shot gun) ? cDNA文庫的建立與基因的分離 ? 直接從特定的 mRNA分離基因 ? 基因組文庫的建立和基因的分離 ? 從蛋白質(zhì)人手分離編碼此蛋白的基因 ? 基因化學(xué)合成法 ? 利用 PCR法或 RTPCR分離基因 基因分離的物理化學(xué)方法 ? 根據(jù) DNA分子的兩條鏈存在著 G≡C、 A=T(分別代表 GC間的三個(gè)氫鍵、 AT間二個(gè)氫鍵 )堿基配對(duì)。 基因的化學(xué)合成 ? 2．基因的化學(xué)一酶促合成： ? 此方法的特點(diǎn)是不需要合成組成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是合成其中一些片段，相鄰的 3’－末端有一短的順序相互補(bǔ)，在適當(dāng)?shù)臈l件下通過退火形成模板－引物的復(fù)合體 (templateprimer plex)，然后在存在四種 dNTP的條件下，用E． coli的 DNA聚合酶 I大片段 (Klenow片段 )去填補(bǔ)互補(bǔ)片段之間的缺口，最后用 T4DNA連接酶連接及適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割后重組入載體 (圖 145)。 ? (3) 用銜接物連接平末端 DNA分子 ? 如果重組體 DNA是用 T4DNA連接酶的平末端連接或是用同聚物加尾構(gòu)建的，那么就無法用原來的限制酶作特異的切割，因此也不能獲得插入 DNA片段。 ? 7．細(xì)胞核的顯微注射法。 導(dǎo)入方法 ? 5．原生質(zhì)體融合。此方法常用于病毒核酸的定量檢測。 一、基礎(chǔ)理論研究： ?基因的結(jié)構(gòu)與功能?！笆斋@”工作比較復(fù)雜，這里不再介紹。如 α 螺旋、 β 折疊和β 轉(zhuǎn)角等。 維持四級(jí)結(jié)構(gòu)的主要力靠疏水鍵。這是新一代的基因工程，因而蛋白質(zhì)工程也稱為第二代基因工程。 167。 167。借助定點(diǎn)突變技術(shù)，研究人員確定了嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)生的新支鏈淀粉酶的活性中心。 其中固定化酶技術(shù)是酶工程的核心。 ? 一、菌種的活化和擴(kuò)大培養(yǎng) ? (一 )菌種活化 ? (二 )菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) ? 二、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備 ? 1．碳源，碳源是指能向細(xì)胞提供碳素的含碳化合物。 ? (三 )溶解氧 ? 在發(fā)酵過程中應(yīng)連續(xù)不斷地供給無菌空氣，同時(shí)進(jìn)行攪拌以增加培養(yǎng)基中溶解氧的含量。 43 酶的分離純化 ? ? ①首先獲得出發(fā)酶液。氮源分為有機(jī)氮和無機(jī)氮。 生命活動(dòng)過程中的新陳代謝所涉及的各種 化學(xué)反應(yīng)由各種酶的催化來實(shí)現(xiàn)。 修飾 Nisin的生物防腐效應(yīng) (Nisin)乳酸鏈球菌素，是一種乳酸鏈球菌在代謝過程中合成和分泌的有較強(qiáng)抑菌作用的小分子肽，是目前研究最多，應(yīng)用最廣，由乳酸菌產(chǎn)生的唯一能應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)的細(xì)菌素。 一般來說提高蛋白的穩(wěn)定性包括以下幾個(gè)方面：①延長酶的半衰期；②提高酶的熱穩(wěn)定性；③延長藥用蛋白質(zhì)的保存期；④抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失。 ? 利用目的基因表型具有高效檢測篩選系統(tǒng)這一特性，在目標(biāo)條件下從隨機(jī)誘變基因庫中分離出目標(biāo)基因，最終獲得突變蛋白質(zhì)。 嚴(yán)格地說蛋白質(zhì)工程就是以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究為基礎(chǔ)，運(yùn)用遺傳工程的方法，借助計(jì)算機(jī)信息處理技術(shù)的支持，從改變和合成基因入手，定向地改造天然蛋白質(zhì)或設(shè)計(jì)全新的人工蛋白質(zhì)分子，使之具有特定的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，能更好地為人類服務(wù)的一種生物技術(shù)。構(gòu)成四級(jí)結(jié)構(gòu)的原體可排列成二聚體、三聚體、四聚體、五聚體，最多可聚合成六十聚體等。二級(jí)結(jié)構(gòu)不涉及氨基酸殘基的側(cè)鏈構(gòu)象。 31蛋白結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和蛋白質(zhì)工程的原理 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本構(gòu)件 在自然界中，構(gòu)成生命最基本的物質(zhì)有蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂類等生物大分子，其中蛋白質(zhì)最為重要，核酸則最為根本。 ?人類基因組計(jì)劃 ? 基因工程是一項(xiàng)非常復(fù)雜的技術(shù)操作，它的環(huán)節(jié)之繁多、操作之細(xì)致是其他工程所無法比擬的。如果被檢測 DNA片段與核酸探針具有互補(bǔ)序列，就能在被檢測 DNA的條帶部位結(jié)合成雙鏈的雜交分子，并通過放射自顯影顯示出黑色條帶來。經(jīng)過細(xì)胞膜融合，細(xì)菌內(nèi)容物轉(zhuǎn)入動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中，質(zhì)粒DNA被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。這是將重組的質(zhì)?；蚴删w DNA導(dǎo)入細(xì)菌中所用的常規(guī)方法，前者叫轉(zhuǎn)化 (transformation)后者叫轉(zhuǎn)染 (transfection)。 ? 所謂銜接物 (linker)，是指用化學(xué)方法合成的一段由10—12個(gè)核苷酸組成的、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸片段。 ? PCR法 PCR擴(kuò)增法 黏性末端連接 平段連接 由同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割的不同 DNA 片段具有完全相同的末端； 由兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割的 DNA片段具有相同類型的黏性末端； 黏性末端連接 ? 如果目的基因的 DNA片段是用限制性內(nèi)切酶切割并有 黏性末端 ，則用同一種限制性內(nèi)切酶處理載體 DNA，使其成為黏性末端。這樣，人們可以通過控制熔解使富 A=T區(qū)解鏈變性，而富 G≡C區(qū)仍維持雙鏈?？刹迦腴L度約為 20kb的外源 DNA。 ? ③具有多克隆位點(diǎn) MCS區(qū)段 MCS可以使兩種不同黏性末端的外源 DNA片段，無需借助其它操作而直接克隆到 pUC質(zhì)粒載體上。 ? 具有能夠直接觀察的表型特征 基因克隆載體具備條件 ? 克隆載體必須是安全的。 ? 最常見的是 T4噬菌體 DNA連接酶 ? DNA連接酶 能夠催化 DNA鏈上彼此相鄰