【正文】 鏈 DNA為模板，按 5’ →3’ 的方向合成新生的互補鏈 DNA。 T4DNA聚合酶 ? 這是由 T4噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物純化而來，具有兩種酶催活性，即 5’→3’ 的聚合酶活性和 3’→5’ 的核酸外切酶活性。 主要用途是通過 DNA缺口平移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的 DNA探針(圖 2—2) Klenow酶的主要用途 ? ① 修補經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化或其他方法所形成的 5’或 3’突出末端，制備平末端。 DNA連接酶 ? DNA連接酶就可以用來在體外連接 DNA片段 ? DNA連接酶的作用 ? 是將雙螺旋 DNA分子的某一條鏈上兩個相鄰核苷酸之失去一個磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈缺口封閉起來，即催化 339。 Ⅱ 型 限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 切割方式 DNA的限制性酶切 Ⅱ 型 限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 ? 指來源不同、識別序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。 ? restriction endonuclease ? 這類酶又簡稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶 。 生物工程發(fā)展的趨勢 ? 目前三個平臺： DNA重組、細(xì)胞培養(yǎng)和 DNA芯片 ? 未來將會形成的幾個新的平臺 第二章 基因工程 ? 基因工程基礎(chǔ) 內(nèi) 容 ? 基因工程研究 ? 基因工程的應(yīng)用 第一節(jié) 基因工程基礎(chǔ) ? 基因工程的定義、研究內(nèi)容 ? 基因工程的工具酶 ? 基因工程的載體 ? 基因工程中的一些主要分子生物學(xué)方法 基因工程 gene engineering ? 運用限制性內(nèi)切核酸酶、連接酶等酶類將不同 DNA進行體外切割、連接構(gòu)成重組DNA，再將重組 DNA經(jīng)生物介導(dǎo)或直接導(dǎo)入等轉(zhuǎn)移方法引入受體細(xì)胞進行克隆、表達，從而改變生物遺傳性以創(chuàng)造生物新種質(zhì)，或通過大量擴增為人類提供有用產(chǎn)品等的技術(shù)。 ? 1944年美國微生物學(xué)家 Avery等用實驗證明了 DNA是遺傳信息的攜帶者。 酶工程 ? 利用酶、細(xì)胞器或細(xì)胞所具有的特異催化功能以及對酶進行的修飾改造，并借助于生物反應(yīng)器生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品的一項技術(shù)。細(xì)胞工程主要包括動植物細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù) 、 細(xì)胞 融合技術(shù) (也稱細(xì)胞雜交技術(shù) )、 細(xì)胞器移植技術(shù)等 。 ? 基因工程 (gene engineering) 是指在基因水平上的操作井改變生物遺傳特性的 技術(shù)。生物工程概論 動物科技學(xué)院 第一章 緒論 第一節(jié) 生物工程的概述 ? 生物工程的產(chǎn)生及定義 ? 生物工程的種類 1 .1生物工程的產(chǎn)生及定義 生物工程概念的提出 ? 1917年匈牙利工程師提出： 用甜菜作為飼料進行大規(guī)模養(yǎng)豬 ,及利用生物將原料轉(zhuǎn)化成為產(chǎn)品 . ? 19世紀(jì)：人類有意識的利用酵母進行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)：酒精、面包酵母、檸檬酸 ? 1928年 發(fā)現(xiàn)青霉素，同時以獲取細(xì)菌的次級代謝產(chǎn)物 ——抗生素為主要特征的抗生素工業(yè)成為當(dāng)時生物技術(shù)的支柱產(chǎn)業(yè)。即按照人們的需要，用類似工程設(shè)計的方法將不同來源的基因 (DNA 分子 )在體外構(gòu)建成雜種 DNA分子，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù) 制、轉(zhuǎn)錄和表達的操作，也稱 DNA重組技術(shù)。 發(fā)酵工程 ? 發(fā)酵工程 (fermentation engineering)是指利用包括工程微生物在內(nèi)的某些微生物或動 、 植物細(xì)胞及其特定功能 ， 通過現(xiàn)代工程技術(shù)手段 (主要是發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器的自動化 、 高效化 、 功能多樣化 、 大型化 )生產(chǎn)各種特定的有用物質(zhì)；或者把微生物直接用于某些工業(yè)化生產(chǎn)的一種技術(shù) 。 ? 主要包括酶的固定化技術(shù)、細(xì)胞固定化技術(shù)、酶的修飾改造技術(shù)及酶反應(yīng)器的設(shè)計技術(shù)等。 ? 1953年美國學(xué)者 Watson和 Crick發(fā)現(xiàn)了 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)， 1958年 Crick又闡明了 DNA的半保留復(fù)制模式，從而奠定了現(xiàn)代分子生物學(xué)的基礎(chǔ)。 基因工程的基本過程就是利用重組 DNA（ rebinant DNA）技術(shù)，在體外通過人工“剪切（ cut）”和“拼接（ splice）”等方法，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進行增殖，并使重組基因在受體內(nèi)表達，產(chǎn)生出人類需要的基因。 限制性核酸內(nèi)切酶 ? 根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割ＤＮＡ的特點，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類： Ⅰ 型酶、 Ⅱ 型酶、 Ⅲ 型酶 ? Ⅰ 型酶不適合做基因工程的工具酶 ? Ⅲ 型酶在基因工程中也不常用 ? Ⅱ 型酶是基因工程理想的工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶 Ⅱ 型 限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 識別序列和切割位點 切割方式 同尾酶和同裂酶 限制性片段長度： 經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的 DNA片段。 ? 同裂酶指來源不同、而識別序列和切割方式均相同的核酸內(nèi)切酶。OH和 539。 ? ②對具有 3’隱蔽末端的 DNA片段作放射性末端標(biāo)記。 主要用途 ? ① 可將任何形式的雙鏈 DNA制備成平末端的雙鏈 DNA。 (二 )分子克隆中常用的其他工具酶 ? 甲基化酶 ? 末端轉(zhuǎn)移酶 ? 堿性磷酸酶 ? 逆轉(zhuǎn)錄酶 ? S1核酸酶 ? Bal31植酸酶 載體的功能 ： ? 運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 ? 為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力 ? 為外源基因的擴增或表達提供必要的條件 ? Vector，本質(zhì)是 DNA ? 攜帶外源基因進入到受體細(xì)胞的運載工具 基因克隆載體具備條件 ? 在克隆載體合適的位置含有允許外源 DNA片段組入的克隆位點，并且這樣的克隆位點應(yīng)盡可能的多。 根據(jù)導(dǎo)入的受體生物。 質(zhì)粒載體的條件 一種理想的用作克隆載體的質(zhì)粒必須滿足如下幾方面的條件。 pBR322 DNA分子中總共有 24種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識別位點。 ? ①具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。異丙基 —β—D—硫代半乳糖苷 (IPTG)可誘導(dǎo)該片段的合成，而該片段能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型 β半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)互補 (a互補 )。 ? 噬菌體是一類細(xì)菌病毒的總稱。 ? 具有溶原周期的噬菌體稱為溫和噬菌體。 λ噬菌體載體的類型 ? 1．插入型載體 ? 插入型的 λ載體又分免疫功能失活和大腸桿菌 β半乳糖苷酶失活兩種亞型。 柯斯質(zhì)粒載體 ? 柯斯 (cosmid)質(zhì)粒是一類由人工構(gòu)建的質(zhì)粒 —噬菌體雜合載體，它的復(fù)制子來自質(zhì)粒、 cos位點序列來自 λ噬菌體，其克隆能力為 31～ 45kb，而且能夠被包裝成為具有感染性能的噬菌體顆粒。 ? 3．具有高容量的克隆能力 ? 柯斯質(zhì)粒載體的克隆極限可達 45kb左右 ? 核酸分子探針的標(biāo)記 ? 核酸分子的雜交 ? 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 核酸分子探針的標(biāo)記 ? 探針是指在化學(xué)及生物學(xué)意義上能與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用，并可被特殊的方法所測定的分子。 隨機引物的探針標(biāo)記 探針的末端標(biāo)記 ? 是基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域中最常用的基本技術(shù)之一 ? 是基于在適宜的溫度及離子強度等條件下，具有一定同源性的兩條核苷酸單鏈可按堿基互補原則復(fù)性雜交形成雙鏈的原理建立的 ? 雜交的兩條單鏈分別是核酸探針和待測核酸 核酸分子的雜交 核酸分子雜交的分類 ? 核酸原位雜交 ? 菌落原位雜交 ? 斑點狹縫雜交 ? 膜上吸印雜交 目前最常用的一種核酸分子雜交方法 膜上吸印雜交 原理：將待測核酸序列片段通過 吸印技術(shù) 轉(zhuǎn)移結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相標(biāo)記的核酸探針進行雜交并對其實行檢測的方法。 ? 外源基因 （ Foreign gene）：插入到載體內(nèi)的非自身的 DNA片段 ? 基因化學(xué)合成法 ? 基因生物制備法 DNA自動合成儀 ? cDNA文庫法 ? PCR法 ? 基因組文庫法 ? 基因分離的物理化學(xué)方法 ? 鳥槍法 (shot gun) ? cDNA文庫的建立與基因的分離 ? 直接從特定的 mRNA分離基因 ? 基因組文庫的建立和基因的分離 ? 從蛋白質(zhì)人手分離編碼此蛋白的基因 ? 基因化學(xué)合成法 ? 利用 PCR法或 RTPCR分離基因 基因分離的物理化學(xué)方法 ? 根據(jù) DNA分子的兩條鏈存在著 G≡C、 A=T(分別代表 GC間的三個氫鍵、 AT間二個氫鍵 )堿基配對。海膽 rDNA基因的分離就是一例。 ? 直接從基因組中分離目的基因的方法 ? 基因組文庫法 ? 以適當(dāng)?shù)哪康幕蚱巫魈结?，利用高密度的噬菌斑或菌落原位雜交技術(shù)，從大量的噬菌斑或菌落中篩選出含有目的基因的重組體的噬菌斑或菌落，再經(jīng)過擴增，提取其中的重組體，最后即可獲得所需要的目的基因片段。 ? (iii)引物一銜接頭法合成雙鏈 cDNA (圖 142) 。 基因的化學(xué)合成 ? 2．基因的化學(xué)一酶促合成： ? 此方法的特點是不需要合成組成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是合成其中一些片段，相鄰的 3’－末端有一短的順序相互補，在適當(dāng)?shù)臈l件下通過退火形成模板－引物的復(fù)合體 (templateprimer plex)，然后在存在四種 dNTP的條件下，用E． coli的 DNA聚合酶 I大片段 (Klenow片段 )去填補互補片段之間的缺口，最后用 T4DNA連接酶連接及適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割后重組入載體 (圖 145)。 平末端連接 連接平末端 DNA分子的方法有 4種： （ 1）直接用 T4DNA連接酶連接； （ 2）先用 末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶 ，給平末端 DNA分子加上同聚物尾巴之后再用 DNA連接酶進行連接； （ 3）用銜接物連接平末端 DNA分子； （ 4） DNA接頭連接法。 且外源 DNA不能原位刪除下來。③用任何一種方法制備的 DNA片段都可以用這種方法進行連接。 ? (3) 用銜接物連接平末端 DNA分子 ? 如果重組體 DNA是用 T4DNA連接酶的平末端連接或是用同聚物加尾構(gòu)建的，那么就無法用原來的限制酶作特異的切割，因此也不能獲得插入 DNA片段。接著用適當(dāng)?shù)南拗泼赶哂秀暯游锏?DNA分子和克隆載體分子，這樣的結(jié)果使二者都產(chǎn)生出了彼此互補的粘性末端。它是一類由人工合成的一頭具有某種限制性內(nèi)切酶粘末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸片段。 ? 3．聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。 ? 7．細(xì)胞核的顯微注射法。 導(dǎo)入方法 ? 注意以下幾點： (a)用作受體菌的細(xì)胞在培養(yǎng)時要掌握好細(xì)胞密度，一般在 OD 600為0． 4左右為好。 導(dǎo)入方法 ? 2．高壓電穿孔法?；钴S生長的細(xì)胞或菌絲體用消化細(xì)胞壁的酶 (如 driselase)處理變成球形體后，在適當(dāng)濃度的聚乙二醇 6000(PEG一 6000)的介導(dǎo)下將外源 DNA轉(zhuǎn)化入受體細(xì)胞中。 導(dǎo)入方法 ? 5．原生質(zhì)體融合。將 DNA或 RNA包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進行脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合將基因?qū)?。而采?DNA分子雜交的方法，只能在被雜交的 DNA中存在目的基因的一部分 DNA序列，就會出現(xiàn)雜交信號。將這塊固定有 DNA印跡的濾膜干燥后，同放射性標(biāo)記的特異性 DNA或 RNA探針雜交，漂洗除去多余的探針，最后經(jīng)放射自顯影檢測雜交的結(jié)果。此方法常用于病毒核酸的定量檢測。如果待測序的目的基因比較大，測序有困難，也可用 RFLP(限制性片段長度多態(tài)性 )技術(shù)。 (二 )R環(huán)檢測法 :采用 mRNA作探針，利用電子顯微鏡觀察其核酸雜交結(jié)果。 四、目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測 ? 用 RNA印跡 (Northern blotting)法檢測。 一、基礎(chǔ)理論研究： ?基因的結(jié)構(gòu)與功能。它的基本步驟可以大致歸納如下： 小結(jié) ? （ 1）獲取目的基因，即用各種不同的方法取得人所需要的基因，也就是某些 DNA片段。用人工方法，取得目的基因的適宜的載體，即質(zhì)?；虿《?。從這里就可以看出工具酶的重要性，沒有它們，重組工作就寸步難行?！笆斋@”工作比較復(fù)雜，這里不再介紹。 在體內(nèi)，蛋白質(zhì)執(zhí)行著酶催化作用，使新陳代謝能有序地進行，從而表現(xiàn)出各種生命的現(xiàn)象；通過激素的調(diào)節(jié)代謝作用，以確保動物正常的生理活動；產(chǎn)生相應(yīng)的抗體蛋白，使人和動物具有防御疾病和抵抗外界病原侵襲的免疫能力；構(gòu)建成的各種生物膜，形成生物體內(nèi)物質(zhì)和信息交流的通路和能量轉(zhuǎn)換的場所。 從蛋白質(zhì)水解物中分離出來的氨基酸有 20種 ， 除了脯基酸外 ， 所有的氨基酸均可用