【正文】 重組體都能形成清晰的噬菌斑 ? 后者形成無色 (淺藍(lán)色 )的噬菌斑 ? 2．置換型載體 ? 在 λ載體非必要區(qū)的兩側(cè)含有核酸限制性內(nèi)切酶兩個(gè)切點(diǎn)，兩個(gè)切點(diǎn)間的片段被取代后不影響噬菌體生活力的載體。 柯斯質(zhì)粒的特點(diǎn)大體上可歸納成如下 4個(gè)方面。 ? 核酸分子探針是指能與互補(bǔ)核酸系列復(fù)性雜交的特定已知核苷酸片斷。 固相支持物：①硝酸纖維素濾膜 ②尼龍膜 分類： ①涉及 DNA吸印的 southern吸印雜交法 ②涉及 RNA吸印的 northern吸印雜交法 吸印方法：①虹吸轉(zhuǎn)移法 ②電泳轉(zhuǎn)移法 ③真空轉(zhuǎn)移法 膜上吸印雜交 概念 ? southern吸印雜交法 通過虹吸轉(zhuǎn)移法、電泳轉(zhuǎn)移法、真空轉(zhuǎn)移法等轉(zhuǎn)移方法將經(jīng)電泳分離及變性的 DNA片段轉(zhuǎn)移到一定固相支持物上然后進(jìn)行雜交并對(duì)其實(shí)行檢測(cè)的方法 ? northern吸印雜交法 通過虹吸轉(zhuǎn)移法、電泳轉(zhuǎn)移法、真空轉(zhuǎn)移法等轉(zhuǎn)移方法將經(jīng)電泳分離及變性的 RNA片段轉(zhuǎn)移到一定固相支持物上然后進(jìn)行雜交并對(duì)其實(shí)行檢測(cè)的方法 Southern 雜交 PCR技術(shù)是指在模板 DNA、引物和 4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，利用 DNA聚合酶催化合成反應(yīng)，體外擴(kuò)增特異 DNA片段的技術(shù)。如 DNA分子中某段的 G≡C堿基對(duì)含量高，則其熱穩(wěn)定性就高，即其熔解溫度 (Tm)值就高。 鳥槍法 (shot gun) ? 這一方法又叫霰彈法。 ? cDNA：具有與某 RNA鏈呈互補(bǔ)的堿基序列的單鏈 DNA即 plementary DNA之縮寫，或此 DNA鏈與具有與之互補(bǔ)的堿基序列的 DNA鏈所形成的 DNA雙鏈。 ? 5． cDNA的甲基化和接頭的加入 ? 6．雙鏈 cDNA與載體的連接 第一條互補(bǔ) DNA鏈的合成需要 RNA模板、cDNA合成引物、反轉(zhuǎn)錄酶、 4種脫氧核苷三磷酸以及相應(yīng)的緩沖液 (Mg2+)等。 ? 通過 PCR技術(shù)獲取所需要的特異 DNA片段在實(shí)際應(yīng)用用得非常多，但是前提條件是必須對(duì)目的基因有一定的了解，需要設(shè)計(jì)引物。 （ 1）直接用 T4DNA連接酶連接 平末端連接 （ 1） T4DNA連接酶除了能夠封閉具有 3， 一OH和 5’一 P末端的雙鏈 DNA的缺口之外，在存在 ATP和加入高濃度酶（ 10100倍） 和低濃度的聚乙二醇 PEG8000存在的條件下，它還能夠連接具有完全堿基配對(duì)的平末端的DNA分子。 平末端連接 （ 2）同聚物加尾連接平末端 DNA片段 運(yùn)用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，能夠?qū)⒑塑账?(通過脫氧核苷三磷酸前體 )，加到 DNA分子單鏈延伸末端的 3， 一 OH基團(tuán)上，它并不需要模板鏈的存在，它一個(gè)一個(gè)加上核苷酸，構(gòu)成由核苷酸組成的尾巴，長(zhǎng)度可達(dá) 100個(gè)核苷酸。 ? 同聚物加尾法的 不足 之處：①方法煩瑣；②外源片段難以回收。為了解決這個(gè)問題，可采用銜接物法提供必要的序列，進(jìn)行DNA分子的連接。于是便可以按照常規(guī)的粘性末端連接法，將待克隆的 DNA片段同載體分子連接起來 平末端連接 （ 4） DNA接頭連接法 ? DNA銜接物連接法盡管有諸多方面的優(yōu)越性，但也有一個(gè)明顯的缺點(diǎn)，那就是如果待克隆的 DNA片段或基因的內(nèi)部，也含有與所加的銜接物相同的限制位點(diǎn)，這樣在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也就會(huì)把克隆基因切成不同的片段，從而為后繼的亞克隆及其它操作造成麻煩。當(dāng)它的平末端與平末端的外源 DNA片段連接之后，便會(huì)使后者成為具粘性末端的新的 DNA分子，而易于連接重組。 ? 4．磷酸鈣或 DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。 ? 1． CaCl2處理后的細(xì)菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。 (b)制備受體細(xì)胞的整個(gè)過程要在０～ 4℃ 進(jìn)行，并盡量避免污染。通過調(diào)節(jié)外加電場(chǎng)的強(qiáng)度、電脈沖的長(zhǎng)度和用于轉(zhuǎn)化的 DNA濃度可將外源 DNA導(dǎo)入細(xì)菌或真核細(xì)胞。 導(dǎo)入方法 ? 4．磷酸鈣或 DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。通過帶有多拷貝重組質(zhì)粒的細(xì)菌原生質(zhì)體同培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞直接融合。 ? 7．細(xì)胞核的顯微注射法。 1．菌落印跡原位雜交 ? 將被篩選的菌落或噬菌斑，從其生長(zhǎng)的瓊脂平板中通過影印方法，小心地原位轉(zhuǎn)移到放在瓊脂平板表面的硝酸纖維素濾膜上，并保存好原來的菌落或噬菌斑平板作為參照。含有同探針序列同源的DNA的印跡，在 x光底片上呈現(xiàn)黑色的斑點(diǎn)，將膠片同原先保存的參照平板進(jìn)行對(duì)照，即可確定陽性菌落或噬菌斑的位置，從而獲得含有目的基因插入片段的重組礎(chǔ)工業(yè)體克隆。 (二 )核酸雜交法 3． Southern印跡雜交 ? 它首先將初篩的重組 DNA提取出來，用合適的核酸限制性內(nèi)切酶將 DNA切割，并進(jìn)行凝膠電泳分離，然后經(jīng)堿變性，利用干燥的吸水紙產(chǎn)生的毛細(xì)作用，讓液體流經(jīng)凝膠，使 DNA片段由液流攜帶，從凝膠轉(zhuǎn)移并結(jié)合在硝酸纖維素濾膜的表面，最后將此膜同標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行分子雜交。 ? 用限制性內(nèi)切酶對(duì)待克隆的目的基因和已克隆的目的基因進(jìn)行切割，若凝膠電泳結(jié)果不一致，可斷定克隆子中克隆的不是目的基因，或者克隆的目的基因的核苷酸序列已發(fā)生了變化。在臨近雙鏈 DNA的變性溫度下和高濃度 (70％ )的甲酰胺溶液中，雙鏈的 DNA—RNA分子要比雙鏈的 DNA—DNA分子更為穩(wěn)定。根據(jù)轉(zhuǎn)錄的 RNA在一定條件下可以同轉(zhuǎn)錄該種 RNA的模板 DNA鏈進(jìn)行雜交的特性，制備目的基因 DNA探針，變性后同克隆子總RNA雜交，若出現(xiàn)明顯的雜交信號(hào)，可以認(rèn)定進(jìn)入受體細(xì)胞的目的基因轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的 mRNA。 ?基因的人工定點(diǎn)突變。那里面含有一種或幾種遺傳信息的全套遺傳密碼。載體一般帶有必要的標(biāo)志基因，以便進(jìn)行檢測(cè)。 ? （ 4）把重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，即用人工方法，讓攜帶著目的基因的運(yùn)載體進(jìn)入新的生物細(xì)胞里，讓其增殖，由此形成重組 DNA的無性生殖系（即克?。?。 作 業(yè) ? 基因工程的定義、研究?jī)?nèi)容 ? 基因工程研究的理論依據(jù)是什么？ ? 基因工程的工具酶有哪些？其作用是什么？ ? 基因工程的載體有哪些？載體的功能有哪些？ ? Southern雜交、 Northern雜交的概念是什么？ ? PCR技術(shù)的概念、原理及步驟 ? 目的基因的制備方法有哪些？ ? 目的基因與載體重組過程中平末端連接方式有哪幾種？ 第三章 蛋白質(zhì)工程 Protein Engineering 167。 蛋白質(zhì)的生理功能 蛋白質(zhì)是一切生命活動(dòng)的體現(xiàn)者： 構(gòu)成細(xì)胞和生物體的主要成分 調(diào)節(jié)作用：酶，部分激素（如胰島素、生長(zhǎng)激素） 運(yùn)輸作用：如血紅蛋白、載體、肌紅蛋白（貯氧） 免疫作用：如抗體 運(yùn)動(dòng)作用：如肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白 凝血：如纖維蛋白 蛋白質(zhì)經(jīng)干燥后 ， 其元素組成平均值約為： 碳： 50—55％ ；氫： —％ ； 氧： 20—23％ ；氮： 15—17％ ； 硫： ％ 分子量： 10， 000—1， 000， 000道爾頓 化學(xué)組成 生產(chǎn)上常把蛋白質(zhì)不完全水解的產(chǎn)物按分子大小分別稱為 shi、 胨 、 肽 。 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)可劃分為一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)由各種化學(xué)鍵組成。 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)就是由許多氨基酸序列按照一定的排列順序，通過肽鍵相連接而成的多肽鏈結(jié)構(gòu)，每一種蛋白質(zhì)的肽鏈的氨基酸都有一定的排列順序。 α 螺旋和β 折疊是蛋白質(zhì)構(gòu)象的重要單元。在這種結(jié)構(gòu)模型中，肽鏈按層排列，在相鄰的肽鏈之間形成氫鍵，得以鞏固這種結(jié)構(gòu)。這種在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上的肽鏈再折疊，稱為蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。亞基一般是由一條多肽鏈組成的，但有的亞基也可以由幾條多肽鏈組成，這些多肽鏈通常以二硫鍵相連接稱為亞基。四級(jí)結(jié)構(gòu)中的聚合物，大致可分為不對(duì)稱性的聚合物和對(duì)稱性的聚合物。 這一過程也是一種分子雜交 。 目前，在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)已經(jīng)闡明的酶蛋白，其酶分子的活性中心與底物結(jié)合時(shí)，整個(gè)酶分子的立體構(gòu)象有所扭動(dòng)，這種扭動(dòng)引起的張力正是促使底物化學(xué)鍵容易發(fā)生斷裂的基本原因。 20世紀(jì) 80年代初 ， 隨著蛋白質(zhì)晶體學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展 ， 人類可以通過對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的了解 ， 借助計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì) ， 利用基因定位誘變等高新技術(shù)改造基因 ， 以達(dá)到改進(jìn)蛋白質(zhì)某些性質(zhì)的目的 。 蛋白質(zhì)工程的基本內(nèi)容和目的可以概括為：以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，通過化學(xué)和物理手段，對(duì)目標(biāo)基因按預(yù)期設(shè)計(jì)進(jìn)行修飾和改造，合成新的蛋白質(zhì)；對(duì)現(xiàn)有的蛋白質(zhì)加以定向改造、設(shè)計(jì)、構(gòu)建和最終生產(chǎn)出比自然界存在的蛋白質(zhì)功能更優(yōu)良，更符合人類需求的功能蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)工程是在現(xiàn)代生物學(xué)理論和技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上誕生的，同時(shí)也是借助于其他許多學(xué)科相互滲透、相互作用而發(fā)展的。 按照目的蛋白質(zhì)分子的改進(jìn)或構(gòu)建方案 ， 進(jìn)行編碼該蛋白質(zhì)基因的修飾和合成 ， 再通過遺傳工程途徑 ， 在適當(dāng)?shù)妮d體表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)所需要的蛋白質(zhì) 。 有關(guān)一些相關(guān)技術(shù) ： 如微量蛋白質(zhì)的純化鑒定技術(shù)、更有效的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法、計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)的有效性等。 32蛋白質(zhì)工程的工作定義 ? 建立蛋白質(zhì)工程的研究方法系統(tǒng) ? 隨機(jī)誘變基因庫的定向篩選 ? 研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 ? 嚴(yán)格意義上的蛋白質(zhì)工程 ? 在研究某些蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)功能元件相互關(guān)系的基礎(chǔ)上建立起應(yīng)用蛋白質(zhì)工程方法的系統(tǒng)。 ? 一是對(duì)天然蛋白質(zhì)的改造，包括小改、中改以及大改； ? 二是完全重新構(gòu)建一個(gè)自然界中沒有的全新的蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)可以按改造部位的多寡分為三類 ? 第一類為“小改” ? 第二類為“中改” ? 第三類為“大改” 167。 單晶體衍射法是研究蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)最主要的分析手段，分別用于對(duì)結(jié)晶蛋白質(zhì)，單晶體衍射主要對(duì)結(jié)晶蛋白質(zhì)的各向基團(tuán)的空間排布進(jìn)行分析，對(duì)蛋白質(zhì)分子的整體空間構(gòu)架研究作用很大。 蛋白質(zhì)折疊過程研究方法 ? 目前流行的蛋白質(zhì)折疊過程理論是Amfinsen提出的隨機(jī)成核理論：即線性多肽鏈折疊呈現(xiàn)“成核 折卷 凝集”三個(gè)階段。 34蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用 通過基因定點(diǎn)突變或基因克隆的方法 ， 人們就可以對(duì)自然界存在的酶或蛋白質(zhì)進(jìn)行改造 ， 使它們變成適合于工業(yè)化生產(chǎn)的新酶 。 蠟狀芽孢桿菌 梭狀芽孢桿菌1 引入二硫鍵，改善蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性 溶菌酶是一種廣泛用于食品工業(yè)的酶制品，其催化速率隨溫度升高而升高，因此，這種工業(yè)用酶的熱穩(wěn)定性是提高其應(yīng)用潛力的重要標(biāo)準(zhǔn)。通過 PCR定向誘變技術(shù)，研究人員將第 14位和第 78位上的兩個(gè)天門冬酰胺分別轉(zhuǎn)變成蘇氨酸和異亮氨酸殘基，大幅度提高突變酶的熱穩(wěn)定性。 葡萄糖異構(gòu)酶（ GI）能將 D－葡萄糖、 D－木糖和 D－核糖等催化為相應(yīng)的酮糖；在體外一定條件下，它也能催化 D－葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖，因而成為工業(yè)上制備高果糖漿的關(guān)鍵酶；它還用于含木聚糖類物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，是一種具有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值得工業(yè)用酶。 當(dāng)活性中心內(nèi)的谷氨酸和天門冬氨酸殘基分別被具有相反電荷或中性的氨基酸殘基（組氨酸、谷氨酰胺或天門冬酰胺）取代時(shí)，將導(dǎo)致突變體酶裂解 α－ 1， 4糖苷鍵與 α－ 1， 6糖苷鍵的活性比例發(fā)生明顯改變。 ? 蛋白質(zhì)工程的主要研究方法。 本身就是一段 RNA，不需要額外的蛋白酶就可以對(duì)自身進(jìn)行剪切。 酶工程的研究可以促進(jìn)基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程和生化工程的發(fā)展。實(shí)際上有了酶的固定化技術(shù)，酶在工業(yè)生產(chǎn)中的利用價(jià)值才真正得以體現(xiàn)。是最早采用的酶生產(chǎn)技術(shù)。 167。 ? 合成成本高昂，且只能合成已知化學(xué)結(jié)構(gòu)的酶。一般采用淀粉及其水解產(chǎn)物，如糊精、麥芽糖等 ? 2．氮源，能夠向細(xì)胞提供氮素的化合物稱為氮源。 ? 3．無機(jī)鹽類無機(jī)鹽提供細(xì)胞生命活動(dòng)必需的無機(jī)元素，對(duì)培養(yǎng)基的 pH、緩沖能力和滲透壓起調(diào)節(jié)作用。 ? (二 )酶合成的阻遏物 ? 微生物酶的生產(chǎn)受代謝途徑末端產(chǎn)物和分解代謝產(chǎn)物的阻遏。 ? ⑤酶容易分離純化，固定化細(xì)胞顆粒很容易與發(fā)酵液分離，發(fā)酵液中游離細(xì)胞很少，因此有利于酶的分離純化 ? (一 )溫度 ? 不同的微生物生長(zhǎng)有不同的最適溫度，例如黑曲霉的最適溫度為 28～ 32℃ ，枯草桿菌最適溫度是 34—37℃ 。 167。 ? ③ 利用各種技術(shù)將酶沉淀分離。 ? 2． pH 在提純過程中通常采用一定