【正文】 第二章 基因工程 ? 基因工程基礎(chǔ) 內(nèi) 容 ? 基因工程研究 ? 基因工程的應(yīng)用 第一節(jié) 基因工程基礎(chǔ) ? 基因工程的定義、研究內(nèi)容 ? 基因工程的工具酶 ? 基因工程的載體 ? 基因工程中的一些主要分子生物學(xué)方法 基因工程 gene engineering ? 運(yùn)用限制性內(nèi)切核酸酶、連接酶等酶類將不同 DNA進(jìn)行體外切割、連接構(gòu)成重組DNA，再將重組 DNA經(jīng)生物介導(dǎo)或直接導(dǎo)入等轉(zhuǎn)移方法引入受體細(xì)胞進(jìn)行克隆、表達(dá)，從而改變生物遺傳性以創(chuàng)造生物新種質(zhì)，或通過大量擴(kuò)增為人類提供有用產(chǎn)品等的技術(shù)。 Ⅱ 型 限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 切割方式 DNA的限制性酶切 Ⅱ 型 限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 ? 指來源不同、識(shí)別序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。 主要用途是通過 DNA缺口平移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的 DNA探針(圖 2—2) Klenow酶的主要用途 ? ① 修補(bǔ)經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化或其他方法所形成的 5’或 3’突出末端，制備平末端。 修飾的 T7DNA聚合酶 ? 對(duì)天然的 T7DNA聚合酶進(jìn)行修飾，使之完全失去 3’→5’ 的核酸外切酶活性 ? 修飾的 T7DNA聚合酶的加工能力以及在單鏈模板上的聚合作用的速率增加了 3—9倍 ? 測序時(shí)常用此酶，故亦稱測序酶 TaqDNA聚合酶 ? 最適的活性溫度是 72℃ ，連續(xù)保溫 30min仍具有相當(dāng)?shù)幕钚? ? 在補(bǔ)加有四種脫氧核苷三磷酸的反應(yīng)體系中，能以高溫變性的靶 DNA分離出來的單鏈 DNA為模板，按 5’ →3’ 的方向合成新生的互補(bǔ)鏈 DNA。 “322”表示實(shí)驗(yàn)編號(hào)。 ? 與 pBR322質(zhì)粒載體相比， pUC系列的優(yōu)點(diǎn)有如下三方面。這樣，帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌將產(chǎn)生白色菌落。 ? λ噬菌體的 DNA既可以以線性存在又可以以環(huán)狀形式存在，并且能夠自然成環(huán)。 ? 2．具有質(zhì)粒載體的特性 ? 具有質(zhì)粒復(fù)制子 ，具有抗菌素抗性基因 ,也有插入失活克隆位點(diǎn)。 PCR擴(kuò)增方式 第二節(jié) 基因工程研究 ? 目的基因的分離與制備 ? 目的基因與載體的重組 ? 將重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞 ? 重組轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定 ? 克隆基因的表達(dá) ? 目的基因（ Objective gene） 是指準(zhǔn)備導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)的，以研究或應(yīng)用為目的所需要的外源基因稱目的基因。然后，將這些片段混合物隨機(jī)地重組入適當(dāng)?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化后在受體菌 (如 E． coli)中進(jìn)行擴(kuò)增，再用適當(dāng)?shù)暮Y選方法篩選出你所要的基因。 基因的化學(xué)合成 1．基因片段的全化學(xué)合成： 所謂基因片段的全化學(xué)合成是首先合成組成一個(gè)基因的所有片段，相鄰的片段間有4～ 6個(gè)堿基的重疊互補(bǔ)，在適當(dāng)?shù)臈l件下 (主要是溫度條件 )經(jīng)退火后，用 T4 DNA連接酶將各片段以磷酸二酯鍵的共價(jià)鍵形式連接成一個(gè)完整的基因。但平末端連接效率不高，基因操作不經(jīng)常采用。還要注意的是，同聚物加尾法同平末端連接法一樣，重組連接后往往會(huì)重新產(chǎn)生某種核酸限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)。 平末端連接 ? DNA接頭 (adapter)連接法于 1978年由康乃爾大學(xué)吳瑞教授發(fā)明的。 ? 6．脂質(zhì)體法。 (c)為了提高轉(zhuǎn)化率，可選用復(fù)合 CaCl2溶液如“分子克隆”一書所介紹的 FSB溶液。用磷酸鈣和 DNA共沉淀方法時(shí)是將被轉(zhuǎn)染的 DNA同正在溶液中形成的磷酸鈣微粒共沉淀后可能通過內(nèi)吞作用進(jìn)入受體細(xì)胞。 導(dǎo)入方法 篩選和鑒定 遺傳檢測 目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測 目的基因翻譯產(chǎn)物檢測 物理檢測法 核酸分析法 一 、 遺傳檢測 根據(jù)載體表型特征的篩選 根據(jù)插入基因遺傳性狀的篩選 抗藥性標(biāo)記 β —半乳糖苷酶 顯色反應(yīng) 二、核酸分析法 (一 ) PCR法 (二 )核酸雜交法 (三 )DNA測序法 菌落印跡原位雜交 斑點(diǎn)印跡雜交 Southern印跡雜交 (一 )PCR法 ? 根據(jù)含目的基因兩端或兩側(cè)已知核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，以待鑒定的克隆子的總 DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，若獲得特異性擴(kuò)增 DNA片段，表明待鑒定的克隆子含有目的基因。通過放射自顯影，從底片中找出黑點(diǎn)即為陽性斑點(diǎn)。 三、物理檢測法 (一 )凝膠電泳檢測法 (二 )R環(huán)檢測法 (一 )凝膠電泳檢測法 :利用凝膠電泳檢測重組質(zhì)粒 DNA分子的大小，也可以初步證明外源目的基因片段是否已插入載體。提取克隆子總蛋白質(zhì)，經(jīng) SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳按分子大小分開后，轉(zhuǎn)移到供雜交用的膜上，隨后與放射性同位素或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，通過一系列抗原抗體反應(yīng)，在雜交膜上顯示出明顯的雜交信號(hào)，表明受體細(xì)胞中存在目的基因表達(dá)產(chǎn)物。 ? （ 2）獲取基因載體。前幾步工作是“播種”，這一步工作則是“收獲”。 短肽可以進(jìn)一步水解成氨基酸 ， 并成為蛋白質(zhì)水解的最小單位 ， 是組成蛋白質(zhì)的基本單位 。 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈主鏈骨架中的若干肽段，各自沿著某個(gè)軸盤旋或折疊，并以氫鍵維系，從而形成有規(guī)則的構(gòu)象。 在自然界中，多數(shù)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)呈球狀。由亞基組成的寡聚蛋白結(jié)構(gòu)被稱為四級(jí)結(jié)構(gòu)，側(cè)重強(qiáng)調(diào)亞基之間的相互作用和空間排布情況。 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)分子所具有的多種多樣的生物學(xué)功能是與它們特殊的和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)的 。 蛋白質(zhì)工程的概念和起源 蛋白質(zhì)工程的概念和起源 ? 1982年， Winter等首次報(bào)道了通過基因定位誘變獲得改性的酪氨酸 tRNA合成酶； ? 1983年， Ulmer在 《 科學(xué) 》 雜志上發(fā)表了以“ Protein Engineering”（蛋白質(zhì)工程）為題的專論，這標(biāo)志著人們能按自己的意愿創(chuàng)造出適合人類需求的新基因，并能表達(dá)出具有不同功能的蛋白質(zhì)。 以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究為基礎(chǔ) ， 掌握蛋白質(zhì)活性中心的結(jié)構(gòu) ， 了解構(gòu)成中心的各氨基酸殘基及其側(cè)鏈基團(tuán)的位置 ， 再借助計(jì)算機(jī)圖像與處理系統(tǒng)的模擬進(jìn)行分子設(shè)計(jì) ， 提出對(duì)目的蛋白質(zhì)的改建或構(gòu)建方案 ， 確定活性中心的氨基酸殘基組成 ， 并輔助設(shè)計(jì)和預(yù)測其結(jié)構(gòu)功能的變化 。許多突變的工程酶，如枯草桿菌蛋白酶工程酶，已獲得了專利，并已廣泛應(yīng)用于食品、輕化工行業(yè)了。 蛋白質(zhì)構(gòu)象研究方法 在蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)研究方面，一種是單晶體衍射法另一種是核磁共振（ NMR）法。 ? 寡居核苷酸片段及基因的人工合成 ? 目的基因的克隆與分析 ? 目的基因的定位誘變 ? 目的基因高效表達(dá)系統(tǒng) 蛋白質(zhì)工程主要研究手段是利用所謂的反向生物學(xué)技術(shù)，其基本思路是按期望的結(jié)構(gòu)尋找最適合的氨基酸序列，通過計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)，進(jìn)而模擬特定的氨基酸序列在細(xì)胞內(nèi)或體內(nèi)環(huán)境中進(jìn)行多肽折疊而成三維結(jié)構(gòu)的全過程，并預(yù)測蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和表達(dá)出生物學(xué)功能的可能及其高低程度。 轉(zhuǎn)化氨基酸殘基，改善蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性 研究人員對(duì)釀酒酵母的磷酸丙糖異構(gòu)酶進(jìn)行誘變改造。 酪氨酰 tPNA合成酶的氨?；钚? 酶 Kcat/s Km/mol Kcat/Km(s1mol1?L) Thr51 1 860 Ala51 3 200 Pro–51 95 800 修飾酶的催化特異性 利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)可以改變新支鏈淀粉酶的催化特異性。 第四章 enzyme engineering 167。 ? 2．菌種的分離 ? (1)含菌樣品的收集 ? (2)富集培養(yǎng) ? (3)菌種的純化 ? ? (三 )產(chǎn)酶微生物育種 ? 1．誘變育種 ? 2．原生質(zhì)體融合育種 ? 3．基因工程育種 ? (四 )菌種的保藏 ? 1．斜面冰箱保藏法 ? 2．沙土管保藏法 ? 3．石蠟油封保藏法 ? 4．真空干燥冷凍保藏 ? ．液氮超低溫保藏法 （ 1）對(duì)生物寶庫中存在天然酶的開發(fā)和生產(chǎn)； （ 2）自然酶的分離純化及鑒定技術(shù)； （ 3）酶的固定化技術(shù)（酶和細(xì)胞固定化）； （ 4）酶反應(yīng)器的研制和應(yīng)用； （ 5）與其他生物技術(shù)領(lǐng)域的交叉和滲透。 ? 簡單方便，但受氣候、地理環(huán)境的影響，產(chǎn)品含雜質(zhì)較多，分離純化較困難。 –復(fù)篩：在初篩基礎(chǔ)上篩選產(chǎn)酶量高、性能更符合要求的菌株。 ? 三、酶合成的促進(jìn)劑和阻遏物 ? (一 )酶合成的促進(jìn)劑 ? 在培養(yǎng)基中少量添加就明顯著增加酶產(chǎn)量的物質(zhì)，統(tǒng)稱為產(chǎn)酶促進(jìn)劑．它們大多屬于酶合成的誘導(dǎo)物、酶的穩(wěn)定劑或表面活性劑。例如，黑曲霉既可產(chǎn)生，淀粉酶，又可產(chǎn)生糖化酶，當(dāng)培養(yǎng)基的 pH偏中性時(shí)，有利于淀粉酶的生產(chǎn)；而當(dāng) pH偏酸性時(shí)．糖化酶產(chǎn)量提高，淀粉酶產(chǎn)量降低。 ? ⑤當(dāng)對(duì)酶產(chǎn)品的純度要求很高時(shí)，還需要精制。如果微生物發(fā)酵生產(chǎn)的是胞外酶，液體發(fā)酵的培養(yǎng)液或固體培養(yǎng)物的抽提液就是出發(fā)酶液；如果發(fā)酵生產(chǎn)的是胞內(nèi)酶，先分離收集菌體，將其破碎，再利用提取液將酶抽提至液相，即獲得出發(fā)酶液。 ? ②可進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，固定化細(xì)胞固定在載體上，不易脫落，可反復(fù)使用多次。有機(jī)氮主要是各種蛋白質(zhì)材料及蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物 。 ? 根據(jù)微生物培養(yǎng)方式的不同，分為固體培養(yǎng)法、液體深層法、固定化細(xì)胞和固定化原生質(zhì)體法等。 （ 1）生命活動(dòng)規(guī)律； （ 2）生物工程的工具； （ 3）醫(yī)藥工業(yè)（疾病發(fā)生、診斷和治療等）； （ 4）工農(nóng)業(yè)、環(huán)保等領(lǐng)域的應(yīng)用； （ 5）分析工具。酶工程是現(xiàn)代酶學(xué)理論與化工技術(shù)的交叉技術(shù)，它的應(yīng)用主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域。 鏈球菌 思考題 ? 蛋白質(zhì)工程的定義、原理。 酵母菌 啤酒酵母 改變酶的最適 pH值條件 改變工業(yè)用酶的最適 pH值是蛋白質(zhì)工程研究和實(shí)踐中的另一個(gè)重要目標(biāo)。 消除酶的被抑制特性 芽孢桿菌是工業(yè)上發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì)水解酶的主要生產(chǎn)酶，枯草芽孢桿菌的不同菌株產(chǎn)生的胞外堿性蛋白酶統(tǒng)稱為枯草桿菌蛋白酶 。 核磁共振（ NMR）法是對(duì)溶液中蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的研究。 ? 利用各種方法，包括蛋白質(zhì)工程的方法，研究和闡明蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，并且盡可能達(dá)到定量描述的水平。 蛋白質(zhì)工程的原理 蛋白質(zhì)工程操作中的問題 有關(guān)分子遺傳學(xué)和基因工程的問題 ； 如更有效 cDNA克隆技術(shù)，精確高效的定位突變技術(shù)，高效目的基因表達(dá)系統(tǒng)等等。 蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)天然蛋白質(zhì)進(jìn)行改造改良或全新設(shè)計(jì)模擬 ， 使目的蛋白質(zhì)具有特殊的結(jié)構(gòu)和性質(zhì) ， 能夠抵御外界的不良環(huán)境 ，因而蛋白質(zhì)具有廣闊的應(yīng)用前景 。 20世紀(jì) 60年代初 ， 隨著生物化學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展和延伸 ， 人們對(duì)生物的遺傳物質(zhì) ——DNA結(jié)構(gòu)與功能已經(jīng)有了比較清楚的認(rèn)識(shí) 。 蛋白質(zhì)分子之間的相互作用 在一定條件下 ， 蛋白質(zhì)亞基的聚合可以被解離成游離的亞基 ， 但在適當(dāng)?shù)臈l件下 ， 這些游離的亞基又能重新聚合成具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子 。 維持蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)最重要的作用力是疏水鍵的相互作用 。 α 螺旋的螺距（ pitch），螺旋每繞一圈（ 360）為殘基，每個(gè)重復(fù)單位沿螺旋軸上升。 蛋白質(zhì)是由許多氨基酸按一定的排列順序通過肽鍵相連而成的多肽鏈。 各種生物功能 、 生命現(xiàn)象和生理活動(dòng)往往是通過蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的 ， 蛋白質(zhì)不僅是生物體的重要組分 ， 更重要的是它與生命活動(dòng)有著十分密切的關(guān)系 。這些工作都在生物體外進(jìn)行，所以基因工程操作又叫體外 DNA重組。但是如果拋開細(xì)節(jié)問題，基因工程操作流程還是比較明了的。這種由單鏈 DNA分支和雙鏈 DNARNA分支形成的“泡狀”體，叫做 R環(huán)結(jié)構(gòu)。 (二 )核酸雜交法 (三 )DNA測序法 ? 進(jìn)行目的基因的核苷酸測序。然后 80℃ 下烘烤濾膜，使變性 DNA原位同硝酸纖維素濾膜形成不可逆的結(jié)合。 ? 6．脂質(zhì)體法。這種方法常用于轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞以及其它真菌細(xì)胞。作為受體細(xì)胞的細(xì)菌經(jīng)一定濃度的冰冷 CaCl2(50100mmol／ L)溶液處理后變成所謂感受態(tài)細(xì)胞(Competent cells)處在感受態(tài)的菌體有攝取各種外源 DNA的能力。 ? 2．高壓電穿孔法。 平末端連接 ? 銜接物的 5， －末端和待克隆的 DNA片段 5， —末端，用 多核苷酸激酶 處理