【正文】 167。一般采用淀粉及其水解產(chǎn)物，如糊精、麥芽糖等 ? 2．氮源，能夠向細胞提供氮素的化合物稱為氮源。實際上有了酶的固定化技術(shù)，酶在工業(yè)生產(chǎn)中的利用價值才真正得以體現(xiàn)。 當活性中心內(nèi)的谷氨酸和天門冬氨酸殘基分別被具有相反電荷或中性的氨基酸殘基（組氨酸、谷氨酰胺或天門冬酰胺）取代時，將導(dǎo)致突變體酶裂解 α－ 1， 4糖苷鍵與 α－ 1， 6糖苷鍵的活性比例發(fā)生明顯改變。 34蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用 通過基因定點突變或基因克隆的方法 ， 人們就可以對自然界存在的酶或蛋白質(zhì)進行改造 ， 使它們變成適合于工業(yè)化生產(chǎn)的新酶 。 32蛋白質(zhì)工程的工作定義 ? 建立蛋白質(zhì)工程的研究方法系統(tǒng) ? 隨機誘變基因庫的定向篩選 ? 研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 ? 嚴格意義上的蛋白質(zhì)工程 ? 在研究某些蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)功能元件相互關(guān)系的基礎(chǔ)上建立起應(yīng)用蛋白質(zhì)工程方法的系統(tǒng)。 蛋白質(zhì)工程的基本內(nèi)容和目的可以概括為：以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，通過化學(xué)和物理手段，對目標基因按預(yù)期設(shè)計進行修飾和改造，合成新的蛋白質(zhì)；對現(xiàn)有的蛋白質(zhì)加以定向改造、設(shè)計、構(gòu)建和最終生產(chǎn)出比自然界存在的蛋白質(zhì)功能更優(yōu)良，更符合人類需求的功能蛋白質(zhì)。四級結(jié)構(gòu)中的聚合物，大致可分為不對稱性的聚合物和對稱性的聚合物。 α 螺旋和β 折疊是蛋白質(zhì)構(gòu)象的重要單元。 作 業(yè) ? 基因工程的定義、研究內(nèi)容 ? 基因工程研究的理論依據(jù)是什么？ ? 基因工程的工具酶有哪些？其作用是什么？ ? 基因工程的載體有哪些？載體的功能有哪些？ ? Southern雜交、 Northern雜交的概念是什么？ ? PCR技術(shù)的概念、原理及步驟 ? 目的基因的制備方法有哪些？ ? 目的基因與載體重組過程中平末端連接方式有哪幾種？ 第三章 蛋白質(zhì)工程 Protein Engineering 167。 ?基因的人工定點突變。 (二 )核酸雜交法 3． Southern印跡雜交 ? 它首先將初篩的重組 DNA提取出來，用合適的核酸限制性內(nèi)切酶將 DNA切割，并進行凝膠電泳分離，然后經(jīng)堿變性，利用干燥的吸水紙產(chǎn)生的毛細作用，讓液體流經(jīng)凝膠，使 DNA片段由液流攜帶，從凝膠轉(zhuǎn)移并結(jié)合在硝酸纖維素濾膜的表面，最后將此膜同標記的核酸探針進行分子雜交。通過帶有多拷貝重組質(zhì)粒的細菌原生質(zhì)體同培養(yǎng)的哺乳細胞直接融合。 ? 1． CaCl2處理后的細菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。為了解決這個問題，可采用銜接物法提供必要的序列，進行DNA分子的連接。 ? 通過 PCR技術(shù)獲取所需要的特異 DNA片段在實際應(yīng)用用得非常多，但是前提條件是必須對目的基因有一定的了解，需要設(shè)計引物。如 DNA分子中某段的 G≡C堿基對含量高，則其熱穩(wěn)定性就高，即其熔解溫度 (Tm)值就高。 ? 前者凡有外源 DNA插入的 λ重組體都能形成清晰的噬菌斑 ? 后者形成無色 (淺藍色 )的噬菌斑 ? 2．置換型載體 ? 在 λ載體非必要區(qū)的兩側(cè)含有核酸限制性內(nèi)切酶兩個切點，兩個切點間的片段被取代后不影響噬菌體生活力的載體。 ? ②適用于組織化學(xué)方法檢測重組體。 ? 克隆載體能攜帶外源 DNA片段進入受體細胞，或停留在細胞質(zhì)中進行自我復(fù)制；或整合到染色體DNA、線粒體 DNA和葉綠體 DNA中，隨這些DNA同步復(fù)制。 同尾酶和同裂酶 DNA連接酶 ? 能夠?qū)啥?DNA拼接起來的酶類 ? 原核生物主要有兩種類型的 DNA連接酶：E． coli DNA連接酶和 T4 DNA 連接酶。 蛋白質(zhì)工程 ? 蛋白質(zhì)工程 (protein engineering)這一名稱是 1981年由美國基因公司的 Ulmer提出的，它是指在基因工程的基礎(chǔ)上，結(jié)合蛋白質(zhì)晶體學(xué)、計算機輔助設(shè)計和蛋白質(zhì)化學(xué)等多學(xué)科的基礎(chǔ)知識，通過對基因的人工定向改造等手段，對蛋白質(zhì)進行修飾、改造、拼接，以產(chǎn)生能滿足人類需要的新型蛋白質(zhì)的技術(shù)。 生物工程的種類 ? 基因工程 ? 細胞工程 ? 發(fā)酵工程 ? 酶工程 ? 蛋白質(zhì)工程 應(yīng)用： 農(nóng)業(yè)、環(huán)境、食品、醫(yī)藥等多個方面 基因工程 ? 也叫基因操作、遺傳工程或重組 DNA技術(shù)，是 20世紀 70年代以后興起的一門新技術(shù)。 ? 1972年 Berg創(chuàng)建了 DNA體外重組技術(shù)，這標志著生物技術(shù)的核心技術(shù) ——基因工程技術(shù)的開始。 原核生物主要有兩種類型的 DNA連接酶 ? E． coli DNA連接酶 ? T4DNA 連接酶 ? 催化反應(yīng)能量來源 不同 ? T4DNA連接酶用 ATP，而 E． coliDNA連接酶則用 NAD ? 催化平末端連接的能力不同 ? 只有 T4DNA連接酶能夠連接兩條平末端的雙螺旋的 DNA片段 (一 )常用的 DNA聚合酶： ? 大腸桿菌 DNA聚合酶 ? 大腸桿菌 DNA聚合酶Ｉ的 Klenow大片斷酶 ? T4噬菌體 DNA聚合酶 ? T7噬菌體 DNA聚合酶 ? Taq DNA聚合酶 催化 DNA體外合成反應(yīng) DNA聚合酶 DNA聚合酶 I(DNasel)是一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，具有三種不同的酶催活性，即 5’→ 3’的聚合酶活性、 5’→ 3’的核酸外切酶活性和 3’→ 5’的核酸外切酶活性。 pBR322質(zhì)粒載體： “ P”表示是一種質(zhì)粒； “ BR”表示兩位主要構(gòu)建者姓氏的頭一個字母“ ”。當外源 DNA片段插入到質(zhì)粒上的多克隆位點時，可使 β—半乳糖苷酶的氨基端片段失活，破壞 α互補作用。 ? 1．具有 λ噬菌體的特性 ? 高效地轉(zhuǎn)導(dǎo) ， λ噬菌體 DNA同樣的方式環(huán)化起來 ，不能夠通過溶原周期，無法形成子代噬菌體顆粒。這一方法是繞過特定基因分離這一關(guān)口，用生物化學(xué)方法，如用限制性內(nèi)切酶將基因組 DNA進行切割，得到很多在長度上同一般基因大小相當?shù)?DNA片段 (o． 8 106～9 106道爾頓 )。這種反應(yīng)的原因目前尚不清楚。 ? 當然，在遇到這種情況時，一個方法可改用其它類型的銜接物，另一種公認的較好的替代辦法是改用DNA接頭 (adapter)連接法。如果用抗菌素篩選轉(zhuǎn)化體，作為對照的受體菌應(yīng)該在此培養(yǎng)基上不生長。即將目的基因重組體通過顯微注射裝置直接注入細胞核中。經(jīng)多種限制性內(nèi)切酶切割分析，若兩種結(jié)果都一樣，可認為克隆子中克隆的是原定的目的基因，其核苷酸序列沒有變化。獲取目的基因是基因工程操作的關(guān)鍵。 shi和胨僅用于表示分子量較大但不確定的多肽混合物 。在天然蛋白質(zhì)變性時，往往就包含 α 螺旋向β 折疊的轉(zhuǎn)變。 不少多肽和蛋白質(zhì)分子，不論其是否由亞基組成，都能聚合成聚合物。主要包括以下兩大方面：分子遺傳學(xué)的相關(guān)理論與技術(shù)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的相關(guān)的理論與技術(shù)。 33蛋白質(zhì)工程的研究方法 ? 結(jié)構(gòu)分析方法 ? 蛋白質(zhì)的分離純化鑒定方法 ? 功能研究方法 ? 進行結(jié)構(gòu)改造的分子生物學(xué)研究方法 ? 與研究蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)的理論與技術(shù) ? 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析方法 ? 蛋白質(zhì)構(gòu)象研究方法 ? 蛋白質(zhì)折疊過程研究方法 ? 蛋白質(zhì)生物物理研究方法及計算機結(jié)構(gòu)模擬研究 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)研究，既氨基酸序列的測定，其原理是片段重疊、逐級降解、 cDNA以質(zhì)譜法等幾種，其中片段重疊和逐級降解是最常用的方法。 蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)研究表明， T4溶菌酶分子由一條肽鏈構(gòu)成，并在空間上折疊形成兩個相對獨立的單元，酶活性中心位于兩個單元之間，該酶分子的一個重要特性是在第 97位和第 54位殘基上是兩個未形成二硫鍵的半胱氨酸，所以野生性的溶菌酶是不含二硫鍵的蛋白質(zhì)分子。 ? 定點突變技術(shù)。目前在動、植物資源豐富的地區(qū)，仍有使用價值。 ? 4．生長因子生長因子是指細胞生長繁殖所必需的微量有機物質(zhì)，包括維生素、氨基酸、嘧啶、嘌呤等，它們是構(gòu)成輔酶的必需物質(zhì)。 ? ④將獲得的沉淀干燥，研磨成粉，加入適當?shù)姆€(wěn)定劑、填充劑等，做成粉末制劑。 ? ④縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率，在利用固定化細胞發(fā)酵時，第二批次及以后批次的發(fā)酵周期縮短。 – 化學(xué)合成法 ? 現(xiàn)在已可用肽合成儀來進行酶的化學(xué)合成。 酶工程： 酶是基因工程、細胞工程、發(fā)酵工程和生化工程的研究對象和工具。改變食品級酶的最適 pH值條件，使酶適應(yīng)食品加工環(huán)境，在工藝控制上非常重要。核磁共振可以直接對水溶液中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行分析，溶液中的空間構(gòu)象更接近于生物體中的自然狀態(tài)，更能反映蛋白質(zhì)在執(zhí)行功能時的實際構(gòu)象狀態(tài)。 有關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究的理論和技術(shù)； 如準確地由一級機構(gòu)推測高級機構(gòu)、肽鏈折疊的精確控制，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可變性，分子動力學(xué)與蛋白質(zhì)功能的關(guān)系，蛋白質(zhì)在晶體、液體以及細胞中的不同存在狀態(tài)及其對蛋白質(zhì)性質(zhì)、功能的影響等等。 1972年 ， 美國斯坦福大學(xué) Berg成功實現(xiàn)了 DNA重組實驗 ， 從此揭開了基因工程發(fā)展的序幕 ， 并逐步形成了以基因工程為核心內(nèi)容 ，包括細胞工程 、 酶工程 、 發(fā)酵工程在內(nèi)的一系列高新生物技術(shù) 。 從共價結(jié)構(gòu)上看，亞基就是蛋白質(zhì)分子的最小共價單位。蛋白質(zhì)的肽鏈結(jié)構(gòu)成為蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，它包括氨基酸組成、肽鏈數(shù)目、末端組成、氨基酸排列順序和二硫鍵位置等。從這里就可以看出工具酶的重要性，沒有它們，重組工作就寸步難行。 四、目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測 ? 用 RNA印跡 (Northern blotting)法檢測。將這塊固定有 DNA印跡的濾膜干燥后，同放射性標記的特異性 DNA或 RNA探針雜交，漂洗除去多余的探針，最后經(jīng)放射自顯影檢測雜交的結(jié)果?；钴S生長的細胞或菌絲體用消化細胞壁的酶 (如 driselase)處理變成球形體后，在適當濃度的聚乙二醇 6000(PEG一 6000)的介導(dǎo)下將外源 DNA轉(zhuǎn)化入受體細胞中。 ? 3．聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。③用任何一種方法制備的 DNA片段都可以用這種方法進行連接。 ? (iii)引物一銜接頭法合成雙鏈 cDNA (圖 142) 。 隨機引物的探針標記 探針的末端標記 ? 是基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域中最常用的基本技術(shù)之一 ? 是基于在適宜的溫度及離子強度等條件下，具有一定同源性的兩條核苷酸單鏈可按堿基互補原則復(fù)性雜交形成雙鏈的原理建立的 ? 雜交的兩條單鏈分別是核酸探針和待測核酸 核酸分子的雜交 核酸分子雜交的分類 ? 核酸原位雜交 ? 菌落原位雜交 ? 斑點狹縫雜交 ? 膜上吸印雜交 目前最常用的一種核酸分子雜交方法 膜上吸印雜交 原理：將待測核酸序列片段通過 吸印技術(shù) 轉(zhuǎn)移結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相標記的核酸探針進行雜交并對其實行檢測的方法。 ? 具有溶原周期的噬菌體稱為溫和噬菌體。 pBR322 DNA分子中總共有 24種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識別位點。 主要用途 ? ① 可將任何形式的雙鏈 DNA制備成平末端的雙鏈 DNA。 限制性核酸內(nèi)切酶 ? 根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割ＤＮＡ的特點，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類： Ⅰ 型酶、 Ⅱ 型酶、 Ⅲ 型酶 ? Ⅰ 型酶不適合做基因工程的工具酶 ? Ⅲ 型酶在基因工程中也不常用 ? Ⅱ 型酶是基因工程理想的工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶 Ⅱ 型 限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 識別序列和切割位點 切割方式 同尾酶和同裂酶 限制性片段長度： 經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的 DNA片段。 發(fā)酵工程 ? 發(fā)酵工程 (fermentation engineering)是指利用包括工程微生物在內(nèi)的某些微生物或動 、 植物細胞及其特定功能 ， 通過現(xiàn)代工程技術(shù)手段 (主要是發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器的自動化 、 高效化 、 功能多樣化 、 大型化 )生產(chǎn)各種特定的有用物質(zhì)；或者把微生物直接用于某些工業(yè)化生產(chǎn)的一種技術(shù) 。細胞工程主要包括動植物細胞的體外培養(yǎng)技術(shù) 、 細胞 融合技術(shù) (也稱細胞雜交技術(shù) )、 細胞器移植技術(shù)等 。 ? restriction endonuclease ? 這類酶又簡稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶 。 T4DNA聚合酶 ? 這是由 T4噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物純化而來，具有兩種酶催活性，即 5’→3’ 的聚合酶活性和 3’→5’ 的核酸外切酶活性。 具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。 ? 只具有溶菌生長周期的噬菌體顆粒叫烈性噬菌體。 ? 隨機引物法是近年發(fā)展起來的一種較理想的核酸探針的標記方法。 ? cDNA文庫法 cDNA文庫的建立方法 ? 1．分離表達目的基因的組織或細胞