【正文】 ? 易于從宿主細胞中分離，并進行純化。 根據(jù)導(dǎo)入的受體生物。可以分為： ? 大腸桿菌載體 ? 植物載體 ? 酵母載體 ? 動物載體 基因克隆載體分類 大腸桿菌載體 ? 質(zhì)粒載體 ? 噬菌體載體 ? 柯斯質(zhì)粒載體 將外源 DNA導(dǎo)入原核生物細胞 質(zhì)粒載體 質(zhì)粒（ plasmid）是指細菌等生物細胞內(nèi)一類獨立于染色體外而能自我復(fù)制的遺傳物質(zhì)，一般為雙鏈的共價閉合環(huán)狀 DNA。 pBR322質(zhì)粒載體： “ P”表示是一種質(zhì)粒； “ BR”表示兩位主要構(gòu)建者姓氏的頭一個字母“ ”。 “322”表示實驗編號。 質(zhì)粒載體的條件 一種理想的用作克隆載體的質(zhì)粒必須滿足如下幾方面的條件。 1．具有復(fù)制起點 2．具有抗菌素抗性基因 3．具有若干限制酶單一識別位點 4．具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù) 四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素 抗性基因O r i P s t Ⅰ S a l ⅠP v u ⅡA v a ⅠB a m H ⅠH in d ⅢE c o R Ⅰp B R 32 2( a m pr)( t e rr)pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點： 具有較小的分子量； 它的分子量為 4363bp?？寺≥d體的分子量大小不要超過 10kb。 具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。 pBR322 DNA分子中總共有 24種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識別位點。其中 7種內(nèi)切酶的識別位點在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部， 2種識別位點在于這個基因的啟動區(qū)內(nèi)，所以 9個限制酶切位點插入外源片斷可以導(dǎo)致 tetr 基因的失活；另外有 3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識別位點， 具有較高的拷貝數(shù) ,經(jīng)過氯霉素擴增后 ,每個細胞中可積累 10003000拷貝。 ＰＵＣ質(zhì)粒載體 ? pUC系列的載體是通過 pBR322和 M13兩種質(zhì)粒改造而來，它的復(fù)制子來自 pMBl， Amp’抗性基因則是來自 R質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座子。 ? 與 pBR322質(zhì)粒載體相比， pUC系列的優(yōu)點有如下三方面。 ? ①具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。 ? ②適用于組織化學(xué)方法檢測重組體。 ? ③具有多克隆位點 MCS區(qū)段 MCS可以使兩種不同黏性末端的外源 DNA片段，無需借助其它操作而直接克隆到 pUC質(zhì)粒載體上。 a互補 ? 載體的來自 E． coli的 Lac操縱子的 DNA區(qū)段，編碼 β—半乳糖苷酶氨基端的一個片段。異丙基 —β—D—硫代半乳糖苷 (IPTG)可誘導(dǎo)該片段的合成，而該片段能與宿主細胞所編碼的缺陷型 β半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)互補 (a互補 )。當(dāng)培養(yǎng)基中含有 IPTG時，細胞可同時合成這二個功能上互補的片段，使含有此種質(zhì)粒上述受體菌在含有生色底物 5—溴 —4—氯 —3—吲哚 —β—D—半乳糖苷 (X—gal)的培養(yǎng)基上形成藍色菌落。當(dāng)外源 DNA片段插入到質(zhì)粒上的多克隆位點時，可使 β—半乳糖苷酶的氨基端片段失活，破壞 α互補作用。這樣，帶有重組質(zhì)粒的細菌將產(chǎn)生白色菌落。 ? 噬菌體是一類細菌病毒的總稱。 噬菌體載體 ? 噬菌體顆粒的外殼是蛋白質(zhì)，內(nèi)部是核酸。 噬菌體載體 ? 噬菌體的生命周期分為溶菌周期和溶源周期。 ? 只具有溶菌生長周期的噬菌體顆粒叫烈性噬菌體。 ? 具有溶原周期的噬菌體稱為溫和噬菌體。 噬菌體載體 ? λ噬菌體載體 ? M13噬菌體載體 ? 噬菌粒載體 噬菌體載體 柯斯質(zhì)粒載體 ? 也稱黏粒載體，是指一類由人工構(gòu)建的含有 λDNA的 cos位點和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體 ? λ噬菌體基因組是一長度為 48 502bp的線性雙鏈 DNA分子，其末端為長 12個核苷酸的互補單鏈，稱為粘端 (cohesive end， cos)。這是將 DNA包裝到 λ噬菌體顆粒中所需的DNA序列。 ? λ噬菌體的 DNA既可以以線性存在又可以以環(huán)狀形式存在，并且能夠自然成環(huán)。 λ噬菌體載體的類型 ? 1．插入型載體 ? 插入型的 λ載體又分免疫功能失活和大腸桿菌 β半乳糖苷酶失活兩種亞型。 ? 前者凡有外源 DNA插入的 λ重組體都能形成清晰的噬菌斑 ? 后者形成無色 (淺藍色 )的噬菌斑 ? 2．置換型載體 ? 在 λ載體非必要區(qū)的兩側(cè)含有核酸限制性內(nèi)切酶兩個切點，兩個切點間的片段被取代后不影響噬菌體生活力的載體?？刹迦腴L度約為 20kb的外源 DNA。在可取代的區(qū)段中帶有 lacZ基因的相應(yīng)序列時， λ重組體亦可用 β半乳糖苷酶失活法進行篩選。 柯斯質(zhì)粒載體 ? 柯斯 (cosmid)質(zhì)粒是一類由人工構(gòu)建的質(zhì)粒 —噬菌體雜合載體，它的復(fù)制子來自質(zhì)粒、 cos位點序列來自 λ噬菌體，其克隆能力為 31～ 45kb，而且能夠被包裝成為具有感染性能的噬菌體顆粒。 柯斯質(zhì)粒的特點大體上可歸納成如下 4個方面。 ? 1．具有 λ噬菌體的特性 ? 高效地轉(zhuǎn)導(dǎo) ， λ噬菌體 DNA同樣的方式環(huán)化起來 ，不能夠通過溶原周期，無法形成子代噬菌體顆粒。 ? 2．具有質(zhì)粒載體的特性 ? 具有質(zhì)粒復(fù)制子 ，具有抗菌素抗性基因 ,也有插入失活克隆位點。 ? 3．具有高容量的克隆能力 ? 柯斯質(zhì)粒載體的克隆極限可達 45kb左右 ? 核酸分子探針的標記 ? 核酸分子的雜交 ? 多聚酶鏈式反應(yīng) 核酸分子探針的標記 ? 探針是指在化學(xué)及生物學(xué)意義上能與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用，并可被特殊的方法所測定的分子。 ? 核酸分子探針是指能與互補核酸系列復(fù)性雜交的特定已知核苷酸片斷。 核酸分子探針的標記 ? 切刻平移法 ? 隨機引物法 ? 末端標記法 ? 隨機引物是指含有各種可能排列順序的寡聚核苷酸片斷的混合物。 ? 隨機引物法是近年發(fā)展起來的一種較理想的核酸探針的標記方法。 隨機引物的探針標記 探針的末端標記 ? 是基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域中最常用的基本技術(shù)之一 ? 是基于在適宜的溫度及離子強度等條件下，具有一定同源性的兩條核苷酸單鏈可按堿基互補原則復(fù)性雜交形成雙鏈的原理建立的 ? 雜交的兩條單鏈分別是核酸探針和待測核酸 核酸分子的雜交 核酸分子雜交的分類 ? 核酸原位雜交 ? 菌落原位雜交 ? 斑點狹縫雜交 ? 膜上吸印雜交 目前最常用的一種核酸分子雜交方法 膜上吸印雜交 原理：將待測核酸序列片段通過 吸印技術(shù) 轉(zhuǎn)移結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相標記的核酸探針進行雜交并對其實行檢測的方法。 固相支持物：①硝酸纖維素濾膜 ②尼龍膜 分類： ①涉及 DNA吸印的 southern吸印雜交法 ②涉及 RNA吸印的 northern吸印雜交法 吸印方法：①虹吸轉(zhuǎn)移法 ②電泳轉(zhuǎn)移法 ③真空轉(zhuǎn)移法 膜上吸印雜交 概念 ? southern吸印雜交法 通過虹吸轉(zhuǎn)移法、電泳轉(zhuǎn)移法、真空轉(zhuǎn)移法等轉(zhuǎn)移方法將經(jīng)電泳分離及變性的 DNA片段轉(zhuǎn)移到一定固相支持物上然后進行雜交并對其實行檢測的方法 ? northern吸印雜交法 通過虹吸轉(zhuǎn)移法、電泳轉(zhuǎn)移法、真空轉(zhuǎn)移法等轉(zhuǎn)移方法將經(jīng)電泳分離及變性的 RNA片段轉(zhuǎn)移到一定固相支持物上然后進行雜交并對其實行檢測的方法 Southern 雜交 PCR技術(shù)是指在模板 DNA、引物和 4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，利用 DNA聚合酶催化合成反應(yīng)，體外擴增特異 DNA片段的技術(shù)。 多聚酶鏈式反應(yīng) PCR每個循環(huán)需要三步： ①變性 ②退火 ③延伸 ? 反應(yīng)條件 多聚酶鏈式反應(yīng) ? 94℃ 變性 30s ? 55 ℃ 復(fù)性 30s ? 7072 ℃ 延伸 3060s ? 一共進行 30輪左右的循環(huán) 引物 (primer) 是一小段單鏈 DNA或 RNA，作為 DNA復(fù)制的起始點，存在于自然中生物的 DNA復(fù)制（ RNA引物）和聚合酶鏈式反應(yīng) (PCR)中人工合成的引物（通常為 DNA引物）。 PCR擴增方式 第二節(jié) 基因工程研究 ? 目的基因的分離與制備 ? 目的基因與載體的重組 ? 將重組體導(dǎo)入受體細胞 ? 重組轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定 ? 克隆基因的表達 ? 目的基因（ Objective gene） 是指準備導(dǎo)入受體細胞內(nèi)的，以研究或應(yīng)用為目的所需要的外源基因稱目的基因。 ? 外源基因 （ Foreign gene）：插入到載體內(nèi)的非自身的 DNA片段 ? 基因化學(xué)合成法 ? 基因生物制備法 DNA自動合成儀 ? cDNA文庫法 ? PCR法 ? 基因組文庫法 ? 基因分離的物理化學(xué)方法 ? 鳥槍法 (shot gun) ? cDNA文庫的建立與基因的分離 ? 直接從特定的 mRNA分離基因 ? 基因組文庫的建立和基因的分離 ? 從蛋白質(zhì)人手分離編碼此蛋白的基因 ? 基因化學(xué)合成法 ? 利用 PCR法或 RTPCR分離基因 基因分離的物理化學(xué)方法 ? 根據(jù) DNA分子的兩條鏈存在著 G≡C、 A=T(分別代表 GC間的三個氫鍵、 AT間二個氫鍵 )堿基配對。如 DNA分子中某段的 G≡C堿基對含量高，則其熱穩(wěn)定性就高，即其熔解溫度 (Tm)值就高。這樣，人們可以通過控制熔解使富 A=T區(qū)解鏈變性，而富 G≡C區(qū)仍維持雙鏈。當(dāng)利用單鏈核酸酶 s1酶去除解開的單鏈部分，得到富 G≡C區(qū)的 DNA片段。海膽 rDNA基因的分離就是一例。 鳥槍法 (shot gun) ? 這一方法又叫霰彈法。這一方法是繞過特定基因分離這一關(guān)口，用生物化學(xué)方法，如用限制性內(nèi)切酶將基因組 DNA進行切割，得到很多在長度上同一般基因大小相當(dāng)?shù)?DNA片段 (o． 8 106～9 106道爾頓 )。然后，將這些片段混合物隨機地重組入適當(dāng)?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化后在受體菌 (如 E． coli)中進行擴增，再用適當(dāng)?shù)暮Y選方法篩選出你所要的基因。 ? 直接從基因組中分離目的基因的方法 ? 基因組文庫法 ? 以適當(dāng)?shù)哪康幕蚱巫魈结槪酶呙芏鹊氖删呋蚓湓浑s交技術(shù)，從大量的噬菌斑或菌落中篩選出含有目的基因的重組體的噬菌斑或菌落，再經(jīng)過擴增，提取其中的重組體，最后即可獲得所需要的目的基因片段。 ? cDNA：具有與某 RNA鏈呈互補的堿基序列的單鏈 DNA即 plementary DNA之縮寫，或此 DNA鏈與具有與之互補的堿基序列的 DNA鏈所形成的 DNA雙鏈。 ? cDNA文庫法 ? 以適當(dāng)?shù)哪康幕蚱巫魈结槪酶呙芏鹊氖删呋蚓湓浑s交技術(shù)，從大量的噬菌斑或菌落中篩選出含有目的基因的重組體的噬菌斑或菌落，再經(jīng)過擴增，提取其中的重組體，最后即可獲得所需要的目的基因片段。 ? cDNA文庫法 cDNA文庫的建立方法 ? 1．分離表達目的基因的組織或細胞 ? 2．從組織和細胞中制備總體 RNA和 mRNA ? 3．第一條 cDNA鏈的合成 ? 4．第二條 cDNA鏈的合成 ? (i)自身引導(dǎo)法 (圖 115) ? (ii)cDNA第二條鏈的置換合成法 (圖 141)。 ? (iii)引物一銜接頭法合成雙鏈 cDNA (圖 142) 。 ? 5． cDNA的甲基化和接頭的加入 ? 6．雙鏈 cDNA與載體的連接 第一條互補 DNA鏈的合成需要 RNA模板、cDNA合成引物、反轉(zhuǎn)錄酶、 4種脫氧核苷三磷酸以及相應(yīng)的緩沖液 (Mg2+)等。 作為第一條鏈合成反應(yīng)產(chǎn)物的 cDNA：mRNA雜交分子充當(dāng)切口平移的模板。 基因的化學(xué)合成 1．基因片段的全化學(xué)合成： 所謂基因片段的全化學(xué)合成是首先合成組成一個基因的所有片段，相鄰的片段間有4～ 6個堿基的重疊互補，在適當(dāng)?shù)臈l件下 (主要是溫度條件 )經(jīng)退火后，用 T4 DNA連接酶將各片段以磷酸二酯鍵的共價鍵形式連接成一個完整的基因。 基因的化學(xué)合成 ? 2．基因的化學(xué)一酶促合成： ? 此方法的特點是不需要合成組成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是合成其中一些片段，相鄰的 3’－末端有一短的順序相互補，在適當(dāng)?shù)臈l件下通過退火形成模板－引物的復(fù)合體 (templateprimer p