【正文】 蛋白質(zhì)是一切生命活動的體現(xiàn)者： 構(gòu)成細(xì)胞和生物體的主要成分 調(diào)節(jié)作用：酶，部分激素（如胰島素、生長激素） 運(yùn)輸作用：如血紅蛋白、載體、肌紅蛋白（貯氧） 免疫作用：如抗體 運(yùn)動作用：如肌動蛋白、肌球蛋白 凝血：如纖維蛋白 蛋白質(zhì)經(jīng)干燥后 ， 其元素組成平均值約為： 碳： 50—55％ ；氫： —％ ； 氧： 20—23％ ；氮： 15—17％ ； 硫： ％ 分子量： 10， 000—1， 000， 000道爾頓 化學(xué)組成 生產(chǎn)上常把蛋白質(zhì)不完全水解的產(chǎn)物按分子大小分別稱為 shi、 胨 、 肽 。 短肽可以進(jìn)一步水解成氨基酸 ， 并成為蛋白質(zhì)水解的最小單位 ， 是組成蛋白質(zhì)的基本單位 。 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)可劃分為一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)由各種化學(xué)鍵組成。 蛋白質(zhì)是由許多氨基酸按一定的排列順序通過肽鍵相連而成的多肽鏈。 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)就是由許多氨基酸序列按照一定的排列順序，通過肽鍵相連接而成的多肽鏈結(jié)構(gòu)，每一種蛋白質(zhì)的肽鏈的氨基酸都有一定的排列順序。 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈主鏈骨架中的若干肽段，各自沿著某個(gè)軸盤旋或折疊，并以氫鍵維系，從而形成有規(guī)則的構(gòu)象。 α 螺旋和β 折疊是蛋白質(zhì)構(gòu)象的重要單元。 α 螺旋的螺距（ pitch），螺旋每繞一圈（ 360）為殘基，每個(gè)重復(fù)單位沿螺旋軸上升。在這種結(jié)構(gòu)模型中，肽鏈按層排列，在相鄰的肽鏈之間形成氫鍵，得以鞏固這種結(jié)構(gòu)。 在自然界中，多數(shù)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)呈球狀。這種在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上的肽鏈再折疊，稱為蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。 維持蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)最重要的作用力是疏水鍵的相互作用 。亞基一般是由一條多肽鏈組成的，但有的亞基也可以由幾條多肽鏈組成，這些多肽鏈通常以二硫鍵相連接稱為亞基。由亞基組成的寡聚蛋白結(jié)構(gòu)被稱為四級結(jié)構(gòu)，側(cè)重強(qiáng)調(diào)亞基之間的相互作用和空間排布情況。四級結(jié)構(gòu)中的聚合物，大致可分為不對稱性的聚合物和對稱性的聚合物。 蛋白質(zhì)分子之間的相互作用 在一定條件下 ， 蛋白質(zhì)亞基的聚合可以被解離成游離的亞基 ， 但在適當(dāng)?shù)臈l件下 ， 這些游離的亞基又能重新聚合成具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子 。 這一過程也是一種分子雜交 。 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)分子所具有的多種多樣的生物學(xué)功能是與它們特殊的和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)的 。 目前，在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)已經(jīng)闡明的酶蛋白，其酶分子的活性中心與底物結(jié)合時(shí)，整個(gè)酶分子的立體構(gòu)象有所扭動，這種扭動引起的張力正是促使底物化學(xué)鍵容易發(fā)生斷裂的基本原因。 20世紀(jì) 60年代初 ， 隨著生物化學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展和延伸 ， 人們對生物的遺傳物質(zhì) ——DNA結(jié)構(gòu)與功能已經(jīng)有了比較清楚的認(rèn)識 。 20世紀(jì) 80年代初 ， 隨著蛋白質(zhì)晶體學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展 ， 人類可以通過對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的了解 ， 借助計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì) ， 利用基因定位誘變等高新技術(shù)改造基因 ， 以達(dá)到改進(jìn)蛋白質(zhì)某些性質(zhì)的目的 。 蛋白質(zhì)工程的概念和起源 蛋白質(zhì)工程的概念和起源 ? 1982年， Winter等首次報(bào)道了通過基因定位誘變獲得改性的酪氨酸 tRNA合成酶； ? 1983年， Ulmer在 《 科學(xué) 》 雜志上發(fā)表了以“ Protein Engineering”（蛋白質(zhì)工程）為題的專論，這標(biāo)志著人們能按自己的意愿創(chuàng)造出適合人類需求的新基因，并能表達(dá)出具有不同功能的蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)工程的基本內(nèi)容和目的可以概括為：以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，通過化學(xué)和物理手段，對目標(biāo)基因按預(yù)期設(shè)計(jì)進(jìn)行修飾和改造，合成新的蛋白質(zhì)；對現(xiàn)有的蛋白質(zhì)加以定向改造、設(shè)計(jì)、構(gòu)建和最終生產(chǎn)出比自然界存在的蛋白質(zhì)功能更優(yōu)良，更符合人類需求的功能蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)工程技術(shù)對天然蛋白質(zhì)進(jìn)行改造改良或全新設(shè)計(jì)模擬 ， 使目的蛋白質(zhì)具有特殊的結(jié)構(gòu)和性質(zhì) ， 能夠抵御外界的不良環(huán)境 ，因而蛋白質(zhì)具有廣闊的應(yīng)用前景 。 蛋白質(zhì)工程是在現(xiàn)代生物學(xué)理論和技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上誕生的，同時(shí)也是借助于其他許多學(xué)科相互滲透、相互作用而發(fā)展的。 以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究為基礎(chǔ) ， 掌握蛋白質(zhì)活性中心的結(jié)構(gòu) ， 了解構(gòu)成中心的各氨基酸殘基及其側(cè)鏈基團(tuán)的位置 ， 再借助計(jì)算機(jī)圖像與處理系統(tǒng)的模擬進(jìn)行分子設(shè)計(jì) ， 提出對目的蛋白質(zhì)的改建或構(gòu)建方案 ， 確定活性中心的氨基酸殘基組成 ， 并輔助設(shè)計(jì)和預(yù)測其結(jié)構(gòu)功能的變化 。 按照目的蛋白質(zhì)分子的改進(jìn)或構(gòu)建方案 ， 進(jìn)行編碼該蛋白質(zhì)基因的修飾和合成 ， 再通過遺傳工程途徑 ， 在適當(dāng)?shù)妮d體表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)所需要的蛋白質(zhì) 。 蛋白質(zhì)工程的原理 蛋白質(zhì)工程操作中的問題 有關(guān)分子遺傳學(xué)和基因工程的問題 ； 如更有效 cDNA克隆技術(shù)，精確高效的定位突變技術(shù)，高效目的基因表達(dá)系統(tǒng)等等。 有關(guān)一些相關(guān)技術(shù) ： 如微量蛋白質(zhì)的純化鑒定技術(shù)、更有效的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法、計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)的有效性等。許多突變的工程酶，如枯草桿菌蛋白酶工程酶，已獲得了專利，并已廣泛應(yīng)用于食品、輕化工行業(yè)了。 32蛋白質(zhì)工程的工作定義 ? 建立蛋白質(zhì)工程的研究方法系統(tǒng) ? 隨機(jī)誘變基因庫的定向篩選 ? 研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 ? 嚴(yán)格意義上的蛋白質(zhì)工程 ? 在研究某些蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)功能元件相互關(guān)系的基礎(chǔ)上建立起應(yīng)用蛋白質(zhì)工程方法的系統(tǒng)。 ? 利用各種方法，包括蛋白質(zhì)工程的方法，研究和闡明蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，并且盡可能達(dá)到定量描述的水平。 ? 一是對天然蛋白質(zhì)的改造，包括小改、中改以及大改； ? 二是完全重新構(gòu)建一個(gè)自然界中沒有的全新的蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)可以按改造部位的多寡分為三類 ? 第一類為“小改” ? 第二類為“中改” ? 第三類為“大改” 167。 蛋白質(zhì)構(gòu)象研究方法 在蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)研究方面，一種是單晶體衍射法另一種是核磁共振（ NMR）法。 單晶體衍射法是研究蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)最主要的分析手段，分別用于對結(jié)晶蛋白質(zhì)，單晶體衍射主要對結(jié)晶蛋白質(zhì)的各向基團(tuán)的空間排布進(jìn)行分析，對蛋白質(zhì)分子的整體空間構(gòu)架研究作用很大。 核磁共振（ NMR）法是對溶液中蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的研究。 蛋白質(zhì)折疊過程研究方法 ? 目前流行的蛋白質(zhì)折疊過程理論是Amfinsen提出的隨機(jī)成核理論：即線性多肽鏈折疊呈現(xiàn)“成核 折卷 凝集”三個(gè)階段。 ? 寡居核苷酸片段及基因的人工合成 ? 目的基因的克隆與分析 ? 目的基因的定位誘變 ? 目的基因高效表達(dá)系統(tǒng) 蛋白質(zhì)工程主要研究手段是利用所謂的反向生物學(xué)技術(shù)，其基本思路是按期望的結(jié)構(gòu)尋找最適合的氨基酸序列，通過計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)，進(jìn)而模擬特定的氨基酸序列在細(xì)胞內(nèi)或體內(nèi)環(huán)境中進(jìn)行多肽折疊而成三維結(jié)構(gòu)的全過程，并預(yù)測蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和表達(dá)出生物學(xué)功能的可能及其高低程度。 34蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用 通過基因定點(diǎn)突變或基因克隆的方法 ， 人們就可以對自然界存在的酶或蛋白質(zhì)進(jìn)行改造 ， 使它們變成適合于工業(yè)化生產(chǎn)的新酶 。 消除酶的被抑制特性 芽孢桿菌是工業(yè)上發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì)水解酶的主要生產(chǎn)酶，枯草芽孢桿菌的不同菌株產(chǎn)生的胞外堿性蛋白酶統(tǒng)稱為枯草桿菌蛋白酶 。 蠟狀芽孢桿菌 梭狀芽孢桿菌1 引入二硫鍵，改善蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性 溶菌酶是一種廣泛用于食品工業(yè)的酶制品，其催化速率隨溫度升高而升高，因此，這種工業(yè)用酶的熱穩(wěn)定性是提高其應(yīng)用潛力的重要標(biāo)準(zhǔn)。 轉(zhuǎn)化氨基酸殘基，改善蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性 研究人員對釀酒酵母的磷酸丙糖異構(gòu)酶進(jìn)行誘變改造。通過 PCR定向誘變技術(shù)，研究人員將第 14位和第 78位上的兩個(gè)天門冬酰胺分別轉(zhuǎn)變成蘇氨酸和異亮氨酸殘基，大幅度提高突變酶的熱穩(wěn)定性。 酵母菌 啤酒酵母 改變酶的最適 pH值條件 改變工業(yè)用酶的最適 pH值是蛋白質(zhì)工程研究和實(shí)踐中的另一個(gè)重要目標(biāo)。 葡萄糖異構(gòu)酶（ GI）能將 D－葡萄糖、 D－木糖和 D－核糖等催化為相應(yīng)的酮糖；在體外一定條件下，它也能催化 D－葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖，因而成為工業(yè)上制備高果糖漿的關(guān)鍵酶；它還用于含木聚糖類物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，是一種具有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值得工業(yè)用酶。 酪氨酰 tPNA合成酶的氨?；钚? 酶 Kcat/s Km/mol Kcat/Km(s1mol1?L) Thr51 1 860 Ala51 3 200 Pro–51 95 800 修飾酶的催化特異性 利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)可以改變新支鏈淀粉酶的催化特異性。 當(dāng)活性中心內(nèi)的谷氨酸和天門冬氨酸殘基分別被具有相反電荷或中性的氨基酸殘基（組氨酸、谷氨酰胺或天門冬酰胺）取代時(shí)，將導(dǎo)致突變體酶裂解 α－ 1， 4糖苷鍵與 α－ 1， 6糖苷鍵的活性比例發(fā)生明顯改變。 鏈球菌 思考題 ? 蛋白質(zhì)工程的定義、原理。 ? 蛋白質(zhì)工程的主要研究方法。 第四章 enzyme engineering 167。 本身就是一段 RNA，不需要額外的蛋白酶就可以對自身進(jìn)行剪切。酶工程是現(xiàn)代酶學(xué)理論與化工技術(shù)的交叉技術(shù)，它的應(yīng)用主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域。 酶工程的研究可以促進(jìn)基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程和生化工程的發(fā)展。 ? 2．菌種的分離 ? (1)含菌樣品的收集 ? (2)富集培養(yǎng) ? (3)菌種的純化 ? ? (三 )產(chǎn)酶微生物育種 ? 1．誘變育種 ? 2．原生質(zhì)體融合育種 ? 3．基因工程育種 ? (四 )菌種的保藏 ? 1．斜面冰箱保藏法 ? 2．沙土管保藏法 ? 3．石蠟油封保藏法 ? 4．真空干燥冷凍保藏 ? ．液氮超低溫保藏法 （ 1）對生物寶庫中存在天然酶的開發(fā)和生產(chǎn)； （ 2）自然酶的分離純化及鑒定技術(shù)； （ 3）酶的固定化技術(shù)（酶和細(xì)胞固定化）； （ 4）酶反應(yīng)器的研制和應(yīng)用； （ 5）與其他生物技術(shù)領(lǐng)域的交叉和滲透。實(shí)際上有了酶的固定化技術(shù)，酶在工業(yè)生產(chǎn)中的利用價(jià)值才真正得以體現(xiàn)。 （ 1）生命活動規(guī)律； （ 2）生物工程的工具； （ 3）醫(yī)藥工業(yè)（疾病發(fā)生、診斷和治療等）； （ 4）工農(nóng)業(yè)、環(huán)保等領(lǐng)域的應(yīng)用； （ 5）分析工具。是最早采用的酶生產(chǎn)技術(shù)。 ? 簡單方便，但受氣候、地理環(huán)境的影響，產(chǎn)品含雜質(zhì)較多，分離純化較困難。 167。 ? 根據(jù)微生物培養(yǎng)方式的不同，分為固體培養(yǎng)法、液體深層法、固定化細(xì)胞和固定化原生質(zhì)體法等。 ? 合成成本高昂，且只能合成已知化學(xué)結(jié)構(gòu)的酶。 –復(fù)篩：在初篩基礎(chǔ)上篩選產(chǎn)酶量高、性能更符合要求的菌株。一般采用淀粉及其水解產(chǎn)物，如糊精、麥芽糖等 ? 2．氮源，能夠向細(xì)胞提供氮素的化合物稱為氮源。有機(jī)氮主要是各種蛋白質(zhì)材料及蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物 。 ? 3．無機(jī)鹽類無機(jī)鹽提供細(xì)胞生命活動必需的無機(jī)元素，對培養(yǎng)基的 pH、緩沖能力和滲透壓起調(diào)節(jié)作用。 ? 三、酶合成的促進(jìn)劑和阻遏物 ? (一 )酶合成的促進(jìn)劑 ? 在培養(yǎng)基中少量添加就明顯著增加酶產(chǎn)量的物質(zhì)，統(tǒng)稱為產(chǎn)酶促進(jìn)劑．它們大多屬于酶合成的誘導(dǎo)物、酶的穩(wěn)定劑或表面活性劑。 ? (二 )酶合成的阻遏物 ? 微生物酶的生產(chǎn)受代謝途徑末端產(chǎn)物和分解代謝產(chǎn)物的阻遏。 ? ②可進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，固定化細(xì)胞固定在載體上，不易脫落，可反復(fù)使用多次。 ? ⑤酶容易分離純化，固定化細(xì)胞顆粒很容易與發(fā)酵液分離，發(fā)酵液中游離細(xì)胞很少，因此有利于酶的分離純化 ? (一 )溫度 ? 不同的微生物生長有不同的最適溫度，例如黑曲霉的最適溫度為 28～ 32℃ ，枯草桿菌最適溫度是 34—37℃ 。例如，黑曲霉既可產(chǎn)生，淀粉酶，又可產(chǎn)生糖化酶，當(dāng)培養(yǎng)基的 pH偏中性時(shí)，有利于淀粉酶的生產(chǎn)；而當(dāng) pH偏酸性時(shí)．糖化酶產(chǎn)量提高，淀粉酶產(chǎn)量降低。 167。如果微生物發(fā)酵生產(chǎn)的是胞外酶，液體發(fā)酵的培養(yǎng)液或固體培養(yǎng)物的抽提液就是出發(fā)酶液；如果發(fā)酵生產(chǎn)的是胞內(nèi)酶，先分離收集菌體，將其破碎，再利用提取液將酶抽提至液相，即獲得出發(fā)酶液。 ? ③ 利用各種技術(shù)將酶沉淀分離。 ? ⑤當(dāng)對酶產(chǎn)品的純度要求很高時(shí)，還需要精制。 ? 2． pH 在提純過程中通常采用一定