【正文】 縱子的 DNA區(qū)段，編碼 β—半乳糖苷酶氨基端的一個(gè)片段。當(dāng)培養(yǎng)基中含有 IPTG時(shí)，細(xì)胞可同時(shí)合成這二個(gè)功能上互補(bǔ)的片段，使含有此種質(zhì)粒上述受體菌在含有生色底物 5—溴 —4—氯 —3—吲哚 —β—D—半乳糖苷 (X—gal)的培養(yǎng)基上形成藍(lán)色菌落。這樣，帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌將產(chǎn)生白色菌落。 噬菌體載體 ? 噬菌體顆粒的外殼是蛋白質(zhì)，內(nèi)部是核酸。 ? 只具有溶菌生長周期的噬菌體顆粒叫烈性噬菌體。 噬菌體載體 ? λ噬菌體載體 ? M13噬菌體載體 ? 噬菌粒載體 噬菌體載體 柯斯質(zhì)粒載體 ? 也稱黏粒載體，是指一類由人工構(gòu)建的含有 λDNA的 cos位點(diǎn)和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體 ? λ噬菌體基因組是一長度為 48 502bp的線性雙鏈 DNA分子，其末端為長 12個(gè)核苷酸的互補(bǔ)單鏈，稱為粘端 (cohesive end， cos)。 ? λ噬菌體的 DNA既可以以線性存在又可以以環(huán)狀形式存在，并且能夠自然成環(huán)。 ? 前者凡有外源 DNA插入的 λ重組體都能形成清晰的噬菌斑 ? 后者形成無色 (淺藍(lán)色 )的噬菌斑 ? 2．置換型載體 ? 在 λ載體非必要區(qū)的兩側(cè)含有核酸限制性內(nèi)切酶兩個(gè)切點(diǎn)，兩個(gè)切點(diǎn)間的片段被取代后不影響噬菌體生活力的載體。在可取代的區(qū)段中帶有 lacZ基因的相應(yīng)序列時(shí)， λ重組體亦可用 β半乳糖苷酶失活法進(jìn)行篩選。 柯斯質(zhì)粒的特點(diǎn)大體上可歸納成如下 4個(gè)方面。 ? 2．具有質(zhì)粒載體的特性 ? 具有質(zhì)粒復(fù)制子 ，具有抗菌素抗性基因 ,也有插入失活克隆位點(diǎn)。 ? 核酸分子探針是指能與互補(bǔ)核酸系列復(fù)性雜交的特定已知核苷酸片斷。 ? 隨機(jī)引物法是近年發(fā)展起來的一種較理想的核酸探針的標(biāo)記方法。 固相支持物：①硝酸纖維素濾膜 ②尼龍膜 分類： ①涉及 DNA吸印的 southern吸印雜交法 ②涉及 RNA吸印的 northern吸印雜交法 吸印方法：①虹吸轉(zhuǎn)移法 ②電泳轉(zhuǎn)移法 ③真空轉(zhuǎn)移法 膜上吸印雜交 概念 ? southern吸印雜交法 通過虹吸轉(zhuǎn)移法、電泳轉(zhuǎn)移法、真空轉(zhuǎn)移法等轉(zhuǎn)移方法將經(jīng)電泳分離及變性的 DNA片段轉(zhuǎn)移到一定固相支持物上然后進(jìn)行雜交并對(duì)其實(shí)行檢測的方法 ? northern吸印雜交法 通過虹吸轉(zhuǎn)移法、電泳轉(zhuǎn)移法、真空轉(zhuǎn)移法等轉(zhuǎn)移方法將經(jīng)電泳分離及變性的 RNA片段轉(zhuǎn)移到一定固相支持物上然后進(jìn)行雜交并對(duì)其實(shí)行檢測的方法 Southern 雜交 PCR技術(shù)是指在模板 DNA、引物和 4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，利用 DNA聚合酶催化合成反應(yīng)，體外擴(kuò)增特異 DNA片段的技術(shù)。 PCR擴(kuò)增方式 第二節(jié) 基因工程研究 ? 目的基因的分離與制備 ? 目的基因與載體的重組 ? 將重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞 ? 重組轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定 ? 克隆基因的表達(dá) ? 目的基因（ Objective gene） 是指準(zhǔn)備導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)的，以研究或應(yīng)用為目的所需要的外源基因稱目的基因。如 DNA分子中某段的 G≡C堿基對(duì)含量高，則其熱穩(wěn)定性就高，即其熔解溫度 (Tm)值就高。當(dāng)利用單鏈核酸酶 s1酶去除解開的單鏈部分，得到富 G≡C區(qū)的 DNA片段。 鳥槍法 (shot gun) ? 這一方法又叫霰彈法。然后，將這些片段混合物隨機(jī)地重組入適當(dāng)?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化后在受體菌 (如 E． coli)中進(jìn)行擴(kuò)增，再用適當(dāng)?shù)暮Y選方法篩選出你所要的基因。 ? cDNA：具有與某 RNA鏈呈互補(bǔ)的堿基序列的單鏈 DNA即 plementary DNA之縮寫，或此 DNA鏈與具有與之互補(bǔ)的堿基序列的 DNA鏈所形成的 DNA雙鏈。 ? cDNA文庫法 cDNA文庫的建立方法 ? 1．分離表達(dá)目的基因的組織或細(xì)胞 ? 2．從組織和細(xì)胞中制備總體 RNA和 mRNA ? 3．第一條 cDNA鏈的合成 ? 4．第二條 cDNA鏈的合成 ? (i)自身引導(dǎo)法 (圖 115) ? (ii)cDNA第二條鏈的置換合成法 (圖 141)。 ? 5． cDNA的甲基化和接頭的加入 ? 6．雙鏈 cDNA與載體的連接 第一條互補(bǔ) DNA鏈的合成需要 RNA模板、cDNA合成引物、反轉(zhuǎn)錄酶、 4種脫氧核苷三磷酸以及相應(yīng)的緩沖液 (Mg2+)等。 基因的化學(xué)合成 1．基因片段的全化學(xué)合成： 所謂基因片段的全化學(xué)合成是首先合成組成一個(gè)基因的所有片段，相鄰的片段間有4～ 6個(gè)堿基的重疊互補(bǔ)，在適當(dāng)?shù)臈l件下 (主要是溫度條件 )經(jīng)退火后，用 T4 DNA連接酶將各片段以磷酸二酯鍵的共價(jià)鍵形式連接成一個(gè)完整的基因。 ? 通過 PCR技術(shù)獲取所需要的特異 DNA片段在實(shí)際應(yīng)用用得非常多，但是前提條件是必須對(duì)目的基因有一定的了解，需要設(shè)計(jì)引物。切下的目的基因的片段插入到質(zhì)粒的切口處，再加入適量的 DNA連接酶，質(zhì)粒的黏性末端與目的基因 DNA片段的黏性末端就會(huì)因堿基互補(bǔ)配對(duì)而結(jié)合，形成一個(gè)重組DNA分子。 （ 1）直接用 T4DNA連接酶連接 平末端連接 （ 1） T4DNA連接酶除了能夠封閉具有 3， 一OH和 5’一 P末端的雙鏈 DNA的缺口之外，在存在 ATP和加入高濃度酶（ 10100倍） 和低濃度的聚乙二醇 PEG8000存在的條件下，它還能夠連接具有完全堿基配對(duì)的平末端的DNA分子。但平末端連接效率不高，基因操作不經(jīng)常采用。 平末端連接 （ 2）同聚物加尾連接平末端 DNA片段 運(yùn)用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，能夠?qū)⒑塑账?(通過脫氧核苷三磷酸前體 )，加到 DNA分子單鏈延伸末端的 3， 一 OH基團(tuán)上，它并不需要模板鏈的存在，它一個(gè)一個(gè)加上核苷酸，構(gòu)成由核苷酸組成的尾巴，長度可達(dá) 100個(gè)核苷酸。②因?yàn)檩d體和外源片段的末端是互補(bǔ)的黏性末端，所以連接效率較高。 ? 同聚物加尾法的 不足 之處：①方法煩瑣；②外源片段難以回收。還要注意的是，同聚物加尾法同平末端連接法一樣，重組連接后往往會(huì)重新產(chǎn)生某種核酸限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)。為了解決這個(gè)問題，可采用銜接物法提供必要的序列，進(jìn)行DNA分子的連接。 平末端連接 ? 銜接物的 5， －末端和待克隆的 DNA片段 5， —末端，用 多核苷酸激酶 處理使之磷酸化，然后再通過 T4DNA連接酶的作用使兩者連接起來。于是便可以按照常規(guī)的粘性末端連接法，將待克隆的 DNA片段同載體分子連接起來 平末端連接 （ 4） DNA接頭連接法 ? DNA銜接物連接法盡管有諸多方面的優(yōu)越性，但也有一個(gè)明顯的缺點(diǎn)，那就是如果待克隆的 DNA片段或基因的內(nèi)部，也含有與所加的銜接物相同的限制位點(diǎn)，這樣在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也就會(huì)把克隆基因切成不同的片段，從而為后繼的亞克隆及其它操作造成麻煩。 平末端連接 ? DNA接頭 (adapter)連接法于 1978年由康乃爾大學(xué)吳瑞教授發(fā)明的。當(dāng)它的平末端與平末端的外源 DNA片段連接之后，便會(huì)使后者成為具粘性末端的新的 DNA分子，而易于連接重組。 ? 2．高壓電穿孔法。 ? 4．磷酸鈣或 DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。 ? 6．脂質(zhì)體法。 ? 1． CaCl2處理后的細(xì)菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。作為受體細(xì)胞的細(xì)菌經(jīng)一定濃度的冰冷 CaCl2(50100mmol／ L)溶液處理后變成所謂感受態(tài)細(xì)胞(Competent cells)處在感受態(tài)的菌體有攝取各種外源 DNA的能力。 (b)制備受體細(xì)胞的整個(gè)過程要在０～ 4℃ 進(jìn)行，并盡量避免污染。 (c)為了提高轉(zhuǎn)化率，可選用復(fù)合 CaCl2溶液如“分子克隆”一書所介紹的 FSB溶液。通過調(diào)節(jié)外加電場的強(qiáng)度、電脈沖的長度和用于轉(zhuǎn)化的 DNA濃度可將外源 DNA導(dǎo)入細(xì)菌或真核細(xì)胞。這種方法常用于轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞以及其它真菌細(xì)胞。 導(dǎo)入方法 ? 4．磷酸鈣或 DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。用磷酸鈣和 DNA共沉淀方法時(shí)是將被轉(zhuǎn)染的 DNA同正在溶液中形成的磷酸鈣微粒共沉淀后可能通過內(nèi)吞作用進(jìn)入受體細(xì)胞。通過帶有多拷貝重組質(zhì)粒的細(xì)菌原生質(zhì)體同培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞直接融合。 ? 6．脂質(zhì)體法。 ? 7．細(xì)胞核的顯微注射法。 導(dǎo)入方法 篩選和鑒定 遺傳檢測 目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測 目的基因翻譯產(chǎn)物檢測 物理檢測法 核酸分析法 一 、 遺傳檢測 根據(jù)載體表型特征的篩選 根據(jù)插入基因遺傳性狀的篩選 抗藥性標(biāo)記 β —半乳糖苷酶 顯色反應(yīng) 二、核酸分析法 (一 ) PCR法 (二 )核酸雜交法 (三 )DNA測序法 菌落印跡原位雜交 斑點(diǎn)印跡雜交 Southern印跡雜交 (一 )PCR法 ? 根據(jù)含目的基因兩端或兩側(cè)已知核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，以待鑒定的克隆子的總 DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，若獲得特異性擴(kuò)增 DNA片段，表明待鑒定的克隆子含有目的基因。 1．菌落印跡原位雜交 ? 將被篩選的菌落或噬菌斑，從其生長的瓊脂平板中通過影印方法，小心地原位轉(zhuǎn)移到放在瓊脂平板表面的硝酸纖維素濾膜上，并保存好原來的菌落或噬菌斑平板作為參照。然后 80℃ 下烘烤濾膜，使變性 DNA原位同硝酸纖維素濾膜形成不可逆的結(jié)合。含有同探針序列同源的DNA的印跡，在 x光底片上呈現(xiàn)黑色的斑點(diǎn)，將膠片同原先保存的參照平板進(jìn)行對(duì)照，即可確定陽性菌落或噬菌斑的位置，從而獲得含有目的基因插入片段的重組礎(chǔ)工業(yè)體克隆。通過放射自顯影，從底片中找出黑點(diǎn)即為陽性斑點(diǎn)。 (二 )核酸雜交法 3． Southern印跡雜交 ? 它首先將初篩的重組 DNA提取出來，用合適的核酸限制性內(nèi)切酶將 DNA切割，并進(jìn)行凝膠電泳分離，然后經(jīng)堿變性，利用干燥的吸水紙產(chǎn)生的毛細(xì)作用，讓液體流經(jīng)凝膠，使 DNA片段由液流攜帶，從凝膠轉(zhuǎn)移并結(jié)合在硝酸纖維素濾膜的表面，最后將此膜同標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行分子雜交。 (二 )核酸雜交法 (三 )DNA測序法 ? 進(jìn)行目的基因的核苷酸測序。 ? 用限制性內(nèi)切酶對(duì)待克隆的目的基因和已克隆的目的基因進(jìn)行切割，若凝膠電泳結(jié)果不一致，可斷定克隆子中克隆的不是目的基因，或者克隆的目的基因的核苷酸序列已發(fā)生了變化。 三、物理檢測法 (一 )凝膠電泳檢測法 (二 )R環(huán)檢測法 (一 )凝膠電泳檢測法 :利用凝膠電泳檢測重組質(zhì)粒 DNA分子的大小，也可以初步證明外源目的基因片段是否已插入載體。在臨近雙鏈 DNA的變性溫度下和高濃度 (70％ )的甲酰胺溶液中，雙鏈的 DNA—RNA分子要比雙鏈的 DNA—DNA分子更為穩(wěn)定。這種由單鏈 DNA分支和雙鏈 DNARNA分支形成的“泡狀”體，叫做 R環(huán)結(jié)構(gòu)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄的 RNA在一定條件下可以同轉(zhuǎn)錄該種 RNA的模板 DNA鏈進(jìn)行雜交的特性，制備目的基因 DNA探針，變性后同克隆子總RNA雜交，若出現(xiàn)明顯的雜交信號(hào)，可以認(rèn)定進(jìn)入受體細(xì)胞的目的基因轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的 mRNA。提取克隆子總蛋白質(zhì)，經(jīng) SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳按分子大小分開后，轉(zhuǎn)移到供雜交用的膜上，隨后與放射性同位素或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，通過一系列抗原抗體反應(yīng)，在雜交膜上顯示出明顯的雜交信號(hào)，表明受體細(xì)胞中存在目的基因表達(dá)產(chǎn)物。 ?基因的人工定點(diǎn)突變。但是如果拋開細(xì)節(jié)問題，基因工程操作流程還是比較明了的。那里面含有一種或幾種遺傳信息的全套遺傳密碼。 ? （ 2）獲取基因載體。載體一般帶有必要的標(biāo)志基因，以便進(jìn)行檢測。這些工作都在生物體外進(jìn)行，所以基因工程操作又叫體外 DNA重組。 ? （ 4）把重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，即用人工方法，讓攜帶著目的基因的運(yùn)載體進(jìn)入新的生物細(xì)胞里，讓其增殖，由此形成重組 DNA的無性生殖系（即克?。?。前幾步工作是“播種”，這一步工作則是“收獲”。 作 業(yè) ? 基因工程的定義、研究內(nèi)容 ? 基因工程研究的理論依據(jù)是什么？ ? 基因工程的工具酶有哪些？其作用是什么？ ? 基因工程的載體有哪些？載體的功能有哪些？ ? Southern雜交、 Northern雜交的概念是什么？ ? PCR技術(shù)的概念、原理及步驟 ? 目的基因的制備方法有哪些？ ? 目的基因與載體重組過程中平末端連接方式有哪幾種？ 第三章 蛋白質(zhì)工程 Protein Engineering 167。 各種生物功能 、 生命現(xiàn)象和生理活動(dòng)往往是通過蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的 ， 蛋白質(zhì)不僅是生物體的重要組分 ， 更重要的是它與生命活動(dòng)有著十分密切的關(guān)系 。 蛋白質(zhì)的生理功能