【正文】 論與技術(shù)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的相關(guān)的理論與技術(shù)。 這些技術(shù)的融合 ， 促使了蛋白質(zhì)工程這一新興生物技術(shù)領(lǐng)域的誕生 ， 為認(rèn)識(shí)和改造蛋白質(zhì)分子提供了強(qiáng)有力的手段 。 不少多肽和蛋白質(zhì)分子，不論其是否由亞基組成，都能聚合成聚合物。由亞基聚合而成的蛋白質(zhì)分子稱(chēng)為寡聚蛋白。在天然蛋白質(zhì)變性時(shí)，往往就包含 α 螺旋向β 折疊的轉(zhuǎn)變。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是最基本的，它包含著決定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵性因素。 shi和胨僅用于表示分子量較大但不確定的多肽混合物 。 ? （ 5）篩選與培育，即基因表達(dá)產(chǎn)物的鑒定、收集和加工等一系列復(fù)雜過(guò)程的綜合。獲取目的基因是基因工程操作的關(guān)鍵。 五、目的基因翻譯產(chǎn)物檢測(cè) ? 最常用的是蛋白質(zhì)印跡 (Westernblotting)法。經(jīng)多種限制性?xún)?nèi)切酶切割分析，若兩種結(jié)果都一樣，可認(rèn)為克隆子中克隆的是原定的目的基因，其核苷酸序列沒(méi)有變化。 (二 )核酸雜交法 2．斑點(diǎn)印跡雜交 ? 斑點(diǎn)印跡雜交法與菌落印跡原位雜交的原理一樣，但方法更簡(jiǎn)單、迅速，可直接將噬菌體的上清液或是由轉(zhuǎn)化子提取的DNA(RNA)樣品直接點(diǎn)在硝酸纖維素濾膜等固體支持物上，然后同核酸探針進(jìn)行分子雜交。即將目的基因重組體通過(guò)顯微注射裝置直接注入細(xì)胞核中。這是將外源基因?qū)氩溉轭?lèi)細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的常規(guī)方法。如果用抗菌素篩選轉(zhuǎn)化體，作為對(duì)照的受體菌應(yīng)該在此培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。 ? 5．原生質(zhì)體融合。 ? 當(dāng)然，在遇到這種情況時(shí)，一個(gè)方法可改用其它類(lèi)型的銜接物，另一種公認(rèn)的較好的替代辦法是改用DNA接頭 (adapter)連接法。另外．由于添加了許多同聚物的尾巴，可能會(huì)影響外源基因的表達(dá)。這種反應(yīng)的原因目前尚不清楚。 作為第一條鏈合成反應(yīng)產(chǎn)物的 cDNA：mRNA雜交分子充當(dāng)切口平移的模板。這一方法是繞過(guò)特定基因分離這一關(guān)口，用生物化學(xué)方法，如用限制性?xún)?nèi)切酶將基因組 DNA進(jìn)行切割，得到很多在長(zhǎng)度上同一般基因大小相當(dāng)?shù)?DNA片段 (o． 8 106～9 106道爾頓 )。 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR每個(gè)循環(huán)需要三步： ①變性 ②退火 ③延伸 ? 反應(yīng)條件 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ? 94℃ 變性 30s ? 55 ℃ 復(fù)性 30s ? 7072 ℃ 延伸 3060s ? 一共進(jìn)行 30輪左右的循環(huán) 引物 (primer) 是一小段單鏈 DNA或 RNA，作為 DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，存在于自然中生物的 DNA復(fù)制（ RNA引物）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)中人工合成的引物（通常為 DNA引物）。 ? 1．具有 λ噬菌體的特性 ? 高效地轉(zhuǎn)導(dǎo) ， λ噬菌體 DNA同樣的方式環(huán)化起來(lái) ，不能夠通過(guò)溶原周期，無(wú)法形成子代噬菌體顆粒。這是將 DNA包裝到 λ噬菌體顆粒中所需的DNA序列。當(dāng)外源 DNA片段插入到質(zhì)粒上的多克隆位點(diǎn)時(shí)，可使 β—半乳糖苷酶的氨基端片段失活，破壞 α互補(bǔ)作用。 ＰＵＣ質(zhì)粒載體 ? pUC系列的載體是通過(guò) pBR322和 M13兩種質(zhì)粒改造而來(lái)，它的復(fù)制子來(lái)自 pMBl， Amp’抗性基因則是來(lái)自 R質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座子。 pBR322質(zhì)粒載體： “ P”表示是一種質(zhì)粒； “ BR”表示兩位主要構(gòu)建者姓氏的頭一個(gè)字母“ ”。 T7DNA聚合酶 ? 具有 5’→3’ 的聚合酶活性和 3’→5’ 的核酸外切酶活性 ? 主要用途： ? ①用于拷貝大分子量模板的引物延伸反應(yīng)； ? ②如同 DNA聚合酶一樣，可通過(guò)單純的延伸或取代合成的途徑，標(biāo)記 DNA的 3’末端，也可用來(lái)將雙鏈 DNA的 5’或 3’突出端轉(zhuǎn)變成平末端的結(jié)構(gòu)。 原核生物主要有兩種類(lèi)型的 DNA連接酶 ? E． coli DNA連接酶 ? T4DNA 連接酶 ? 催化反應(yīng)能量來(lái)源 不同 ? T4DNA連接酶用 ATP，而 E． coliDNA連接酶則用 NAD ? 催化平末端連接的能力不同 ? 只有 T4DNA連接酶能夠連接兩條平末端的雙螺旋的 DNA片段 (一 )常用的 DNA聚合酶： ? 大腸桿菌 DNA聚合酶 ? 大腸桿菌 DNA聚合酶Ｉ的 Klenow大片斷酶 ? T4噬菌體 DNA聚合酶 ? T7噬菌體 DNA聚合酶 ? Taq DNA聚合酶 催化 DNA體外合成反應(yīng) DNA聚合酶 DNA聚合酶 I(DNasel)是一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，具有三種不同的酶催活性，即 5’→ 3’的聚合酶活性、 5’→ 3’的核酸外切酶活性和 3’→ 5’的核酸外切酶活性。 切割位點(diǎn) ? 切割位點(diǎn)與其識(shí)別序列一致，在其識(shí)別序列內(nèi)切割 DNA。 ? 1972年 Berg創(chuàng)建了 DNA體外重組技術(shù)，這標(biāo)志著生物技術(shù)的核心技術(shù) ——基因工程技術(shù)的開(kāi)始。 。 生物工程的種類(lèi) ? 基因工程 ? 細(xì)胞工程 ? 發(fā)酵工程 ? 酶工程 ? 蛋白質(zhì)工程 應(yīng)用： 農(nóng)業(yè)、環(huán)境、食品、醫(yī)藥等多個(gè)方面 基因工程 ? 也叫基因操作、遺傳工程或重組 DNA技術(shù)，是 20世紀(jì) 70年代以后興起的一門(mén)新技術(shù)。因此，由該技術(shù)構(gòu)建的且具有 新遺傳性狀的生物稱(chēng)為基因工程生物或轉(zhuǎn)基因生物。 蛋白質(zhì)工程 ? 蛋白質(zhì)工程 (protein engineering)這一名稱(chēng)是 1981年由美國(guó)基因公司的 Ulmer提出的，它是指在基因工程的基礎(chǔ)上，結(jié)合蛋白質(zhì)晶體學(xué)、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)化學(xué)等多學(xué)科的基礎(chǔ)知識(shí)，通過(guò)對(duì)基因的人工定向改造等手段，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾、改造、拼接，以產(chǎn)生能滿(mǎn)足人類(lèi)需要的新型蛋白質(zhì)的技術(shù)。 基因工程是用人工的方法把不同生物的遺傳物質(zhì)（基因）分離出來(lái)，在體外進(jìn)行剪切、拼接、重組，形成基因重組體，然后再把重組體引入宿主細(xì)胞或個(gè)體中以得到高效表達(dá)，最終獲得人們所需要的基因產(chǎn)物。 同尾酶和同裂酶 DNA連接酶 ? 能夠?qū)啥?DNA拼接起來(lái)的酶類(lèi) ? 原核生物主要有兩種類(lèi)型的 DNA連接酶：E． coli DNA連接酶和 T4 DNA 連接酶。 ? ③ cDNA克隆中的第二鏈 cDNA的合成。 ? 克隆載體能攜帶外源 DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，或停留在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行自我復(fù)制；或整合到染色體DNA、線粒體 DNA和葉綠體 DNA中，隨這些DNA同步復(fù)制。 1．具有復(fù)制起點(diǎn) 2．具有抗菌素抗性基因 3．具有若干限制酶單一識(shí)別位點(diǎn) 4．具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù) 四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素 抗性基因O r i P s t Ⅰ S a l ⅠP v u ⅡA v a ⅠB a m H ⅠH in d ⅢE c o R Ⅰp B R 32 2( a m pr)( t e rr)pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)： 具有較小的分子量； 它的分子量為 4363bp。 ? ②適用于組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體。 噬菌體載體 ? 噬菌體顆粒的外殼是蛋白質(zhì)，內(nèi)部是核酸。 ? 前者凡有外源 DNA插入的 λ重組體都能形成清晰的噬菌斑 ? 后者形成無(wú)色 (淺藍(lán)色 )的噬菌斑 ? 2．置換型載體 ? 在 λ載體非必要區(qū)的兩側(cè)含有核酸限制性?xún)?nèi)切酶兩個(gè)切點(diǎn)，兩個(gè)切點(diǎn)間的片段被取代后不影響噬菌體生活力的載體。 ? 核酸分子探針是指能與互補(bǔ)核酸系列復(fù)性雜交的特定已知核苷酸片斷。如 DNA分子中某段的 G≡C堿基對(duì)含量高，則其熱穩(wěn)定性就高，即其熔解溫度 (Tm)值就高。 ? cDNA：具有與某 RNA鏈呈互補(bǔ)的堿基序列的單鏈 DNA即 plementary DNA之縮寫(xiě)，或此 DNA鏈與具有與之互補(bǔ)的堿基序列的 DNA鏈所形成的 DNA雙鏈。 ? 通過(guò) PCR技術(shù)獲取所需要的特異 DNA片段在實(shí)際應(yīng)用用得非常多，但是前提條件是必須對(duì)目的基因有一定的了解，需要設(shè)計(jì)引物。 平末端連接 （ 2）同聚物加尾連接平末端 DNA片段 運(yùn)用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，能夠?qū)⒑塑账?(通過(guò)脫氧核苷三磷酸前體 )，加到 DNA分子單鏈延伸末端的 3， 一 OH基團(tuán)上，它并不需要模板鏈的存在，它一個(gè)一個(gè)加上核苷酸，構(gòu)成由核苷酸組成的尾巴，長(zhǎng)度可達(dá) 100個(gè)核苷酸。為了解決這個(gè)問(wèn)題，可采用銜接物法提供必要的序列，進(jìn)行DNA分子的連接。當(dāng)它的平末端與平末端的外源 DNA片段連接之后，便會(huì)使后者成為具粘性末端的新的 DNA分子，而易于連接重組。 ? 1． CaCl2處理后的細(xì)菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。通過(guò)調(diào)節(jié)外加電場(chǎng)的強(qiáng)度、電脈沖的長(zhǎng)度和用于轉(zhuǎn)化的 DNA濃度可將外源 DNA導(dǎo)入細(xì)菌或真核細(xì)胞。通過(guò)帶有多拷貝重組質(zhì)粒的細(xì)菌原生質(zhì)體同培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞直接融合。 1．菌落印跡原位雜交 ? 將被篩選的菌落或噬菌斑，從其生長(zhǎng)的瓊脂平板中通過(guò)影印方法，小心地原位轉(zhuǎn)移到放在瓊脂平板表面的硝酸纖維素濾膜上，并保存好原來(lái)的菌落或噬菌斑平板作為參照。 (二 )核酸雜交法 3． Southern印跡雜交 ? 它首先將初篩的重組 DNA提取出來(lái)，用合適的核酸限制性?xún)?nèi)切酶將 DNA切割，并進(jìn)行凝膠電泳分離，然后經(jīng)堿變性，利用干燥的吸水紙產(chǎn)生的毛細(xì)作用，讓液體流經(jīng)凝膠，使 DNA片段由液流攜帶，從凝膠轉(zhuǎn)移并結(jié)合在硝酸纖維素濾膜的表面，最后將此膜同標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行分子雜交。在臨近雙鏈 DNA的變性溫度下和高濃度 (70％ )的甲酰胺溶液中，雙鏈的 DNA—RNA分子要比雙鏈的 DNA—DNA分子更為穩(wěn)定。 ?基因的人工定點(diǎn)突變。載體一般帶有必要的標(biāo)志基因，以便進(jìn)行檢測(cè)。 作 業(yè) ? 基因工程的定義、研究?jī)?nèi)容 ? 基因工程研究的理論依據(jù)是什么？ ? 基因工程的工具酶有哪些？其作用是什么？ ? 基因工程的載體有哪些？載體的功能有哪些？ ? Southern雜交、 Northern雜交的概念是什么？ ? PCR技術(shù)的概念、原理及步驟 ? 目的基因的制備方法有哪些？ ? 目的基因與載體重組過(guò)程中平末端連接方式有哪幾種？ 第三章 蛋白質(zhì)工程 Protein Engineering 167。 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)可劃分為一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)由各種化學(xué)鍵組成。 α 螺旋和β 折疊是蛋白質(zhì)構(gòu)象的重要單元。這種在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上的肽鏈再折疊，稱(chēng)為蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。四級(jí)結(jié)構(gòu)中的聚合物，大致可分為不對(duì)稱(chēng)性的聚合物和對(duì)稱(chēng)性的聚合物。 目前，在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)已經(jīng)闡明的酶蛋白，其酶分子的活性中心與底物結(jié)合時(shí)，整個(gè)酶分子的立體構(gòu)象有所扭動(dòng)，這種扭動(dòng)引起的張力正是促使底物化學(xué)鍵容易發(fā)生斷裂的基本原因。 蛋白質(zhì)工程的基本內(nèi)容和目的可以概括為：以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，通過(guò)化學(xué)和物理手段，對(duì)目標(biāo)基因按預(yù)期設(shè)計(jì)進(jìn)行修飾和改造，合成新的蛋白質(zhì)；對(duì)現(xiàn)有的蛋白質(zhì)加以定向改造、設(shè)計(jì)、構(gòu)建和最終生產(chǎn)出比自然界存在的蛋白質(zhì)功能更優(yōu)良，更符合人類(lèi)需求的功能蛋白質(zhì)。 按照目的蛋白質(zhì)分子的改進(jìn)或構(gòu)建方案 ， 進(jìn)行編碼該蛋白質(zhì)基因的修飾和合成 ， 再通過(guò)遺傳工程途徑 ， 在適當(dāng)?shù)妮d體表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)所需要的蛋白質(zhì) 。 32蛋白質(zhì)工程的工作定義 ? 建立蛋白質(zhì)工程的研究方法系統(tǒng) ? 隨機(jī)誘變基因庫(kù)的定向篩選 ? 研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 ? 嚴(yán)格意義上的蛋白質(zhì)工程 ? 在研究某些蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)功能元件相互關(guān)系的基礎(chǔ)上建立起應(yīng)用蛋白質(zhì)工程方法的系統(tǒng)。 單晶體衍射法是研究蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)最主要的分析手段，分別用于對(duì)結(jié)晶蛋白質(zhì)，單晶體衍射主要對(duì)結(jié)晶蛋白質(zhì)的各向基團(tuán)的空間排布進(jìn)行分析，對(duì)蛋白質(zhì)分子的整體空間構(gòu)架研究作用很大。 34蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用 通過(guò)基因定點(diǎn)突變或基因克隆的方法 ， 人們就可以對(duì)自然界存在的酶或蛋白質(zhì)進(jìn)行改造 ， 使它們變成適合于工業(yè)化生產(chǎn)的新酶 。通過(guò) PCR定向誘變技術(shù)，研究人員將第 14位和第 78位上的兩個(gè)天門(mén)冬酰胺分別轉(zhuǎn)變成蘇氨酸和異亮氨酸殘基，大幅度提高突變酶的熱穩(wěn)定性。 當(dāng)活性中心內(nèi)的谷氨酸和天門(mén)冬氨酸殘基分別被具有相反電荷或中性的氨基酸殘基（組氨酸、谷氨酰胺或天門(mén)冬酰胺）取代時(shí)，將導(dǎo)致突變體酶裂解 α－ 1， 4糖苷鍵與 α－ 1， 6糖苷鍵的活性比例發(fā)生明顯改變。 本身就是一段 RNA，不需要額外的蛋白酶就可以對(duì)自身進(jìn)行剪切。實(shí)際上有了酶的固定化技術(shù)，酶在工業(yè)生產(chǎn)中的利用價(jià)值才真正得以體現(xiàn)。 167。一般采用淀粉及其水解產(chǎn)物，如糊精、麥芽糖等 ? 2．氮源，能夠向細(xì)胞提供氮素的化合物稱(chēng)為氮源。 ? (二 )酶合成的阻遏物 ? 微生物酶的生產(chǎn)受代謝途徑末端產(chǎn)物和分解代謝產(chǎn)物的阻遏。 167。 ? 2． pH 在提純過(guò)程中通常采用一定