【正文】 論與技術和蛋白質結構功能的相關的理論與技術。 這些技術的融合 ， 促使了蛋白質工程這一新興生物技術領域的誕生 ， 為認識和改造蛋白質分子提供了強有力的手段 。 不少多肽和蛋白質分子，不論其是否由亞基組成，都能聚合成聚合物。由亞基聚合而成的蛋白質分子稱為寡聚蛋白。在天然蛋白質變性時，往往就包含 α 螺旋向β 折疊的轉變。蛋白質的一級結構是最基本的，它包含著決定蛋白質的高級結構的關鍵性因素。 shi和胨僅用于表示分子量較大但不確定的多肽混合物 。 ? （ 5）篩選與培育，即基因表達產(chǎn)物的鑒定、收集和加工等一系列復雜過程的綜合。獲取目的基因是基因工程操作的關鍵。 五、目的基因翻譯產(chǎn)物檢測 ? 最常用的是蛋白質印跡 (Westernblotting)法。經(jīng)多種限制性內切酶切割分析，若兩種結果都一樣，可認為克隆子中克隆的是原定的目的基因，其核苷酸序列沒有變化。 (二 )核酸雜交法 2．斑點印跡雜交 ? 斑點印跡雜交法與菌落印跡原位雜交的原理一樣，但方法更簡單、迅速，可直接將噬菌體的上清液或是由轉化子提取的DNA(RNA)樣品直接點在硝酸纖維素濾膜等固體支持物上，然后同核酸探針進行分子雜交。即將目的基因重組體通過顯微注射裝置直接注入細胞核中。這是將外源基因導入哺乳類細胞中進行瞬時表達的常規(guī)方法。如果用抗菌素篩選轉化體，作為對照的受體菌應該在此培養(yǎng)基上不生長。 ? 5．原生質體融合。 ? 當然，在遇到這種情況時，一個方法可改用其它類型的銜接物，另一種公認的較好的替代辦法是改用DNA接頭 (adapter)連接法。另外．由于添加了許多同聚物的尾巴，可能會影響外源基因的表達。這種反應的原因目前尚不清楚。 作為第一條鏈合成反應產(chǎn)物的 cDNA：mRNA雜交分子充當切口平移的模板。這一方法是繞過特定基因分離這一關口，用生物化學方法，如用限制性內切酶將基因組 DNA進行切割，得到很多在長度上同一般基因大小相當?shù)?DNA片段 (o． 8 106～9 106道爾頓 )。 多聚酶鏈式反應 PCR每個循環(huán)需要三步： ①變性 ②退火 ③延伸 ? 反應條件 多聚酶鏈式反應 ? 94℃ 變性 30s ? 55 ℃ 復性 30s ? 7072 ℃ 延伸 3060s ? 一共進行 30輪左右的循環(huán) 引物 (primer) 是一小段單鏈 DNA或 RNA，作為 DNA復制的起始點，存在于自然中生物的 DNA復制（ RNA引物）和聚合酶鏈式反應 (PCR)中人工合成的引物（通常為 DNA引物）。 ? 1．具有 λ噬菌體的特性 ? 高效地轉導 ， λ噬菌體 DNA同樣的方式環(huán)化起來 ，不能夠通過溶原周期，無法形成子代噬菌體顆粒。這是將 DNA包裝到 λ噬菌體顆粒中所需的DNA序列。當外源 DNA片段插入到質粒上的多克隆位點時，可使 β—半乳糖苷酶的氨基端片段失活，破壞 α互補作用。 ＰＵＣ質粒載體 ? pUC系列的載體是通過 pBR322和 M13兩種質粒改造而來，它的復制子來自 pMBl， Amp’抗性基因則是來自 R質粒的轉座子。 pBR322質粒載體： “ P”表示是一種質粒； “ BR”表示兩位主要構建者姓氏的頭一個字母“ ”。 T7DNA聚合酶 ? 具有 5’→3’ 的聚合酶活性和 3’→5’ 的核酸外切酶活性 ? 主要用途： ? ①用于拷貝大分子量模板的引物延伸反應； ? ②如同 DNA聚合酶一樣，可通過單純的延伸或取代合成的途徑，標記 DNA的 3’末端，也可用來將雙鏈 DNA的 5’或 3’突出端轉變成平末端的結構。 原核生物主要有兩種類型的 DNA連接酶 ? E． coli DNA連接酶 ? T4DNA 連接酶 ? 催化反應能量來源 不同 ? T4DNA連接酶用 ATP，而 E． coliDNA連接酶則用 NAD ? 催化平末端連接的能力不同 ? 只有 T4DNA連接酶能夠連接兩條平末端的雙螺旋的 DNA片段 (一 )常用的 DNA聚合酶： ? 大腸桿菌 DNA聚合酶 ? 大腸桿菌 DNA聚合酶Ｉ的 Klenow大片斷酶 ? T4噬菌體 DNA聚合酶 ? T7噬菌體 DNA聚合酶 ? Taq DNA聚合酶 催化 DNA體外合成反應 DNA聚合酶 DNA聚合酶 I(DNasel)是一種單鏈多肽蛋白質，具有三種不同的酶催活性，即 5’→ 3’的聚合酶活性、 5’→ 3’的核酸外切酶活性和 3’→ 5’的核酸外切酶活性。 切割位點 ? 切割位點與其識別序列一致，在其識別序列內切割 DNA。 ? 1972年 Berg創(chuàng)建了 DNA體外重組技術，這標志著生物技術的核心技術 ——基因工程技術的開始。 。 生物工程的種類 ? 基因工程 ? 細胞工程 ? 發(fā)酵工程 ? 酶工程 ? 蛋白質工程 應用： 農業(yè)、環(huán)境、食品、醫(yī)藥等多個方面 基因工程 ? 也叫基因操作、遺傳工程或重組 DNA技術，是 20世紀 70年代以后興起的一門新技術。因此，由該技術構建的且具有 新遺傳性狀的生物稱為基因工程生物或轉基因生物。 蛋白質工程 ? 蛋白質工程 (protein engineering)這一名稱是 1981年由美國基因公司的 Ulmer提出的，它是指在基因工程的基礎上，結合蛋白質晶體學、計算機輔助設計和蛋白質化學等多學科的基礎知識，通過對基因的人工定向改造等手段，對蛋白質進行修飾、改造、拼接，以產(chǎn)生能滿足人類需要的新型蛋白質的技術。 基因工程是用人工的方法把不同生物的遺傳物質（基因）分離出來，在體外進行剪切、拼接、重組，形成基因重組體，然后再把重組體引入宿主細胞或個體中以得到高效表達，最終獲得人們所需要的基因產(chǎn)物。 同尾酶和同裂酶 DNA連接酶 ? 能夠將兩端 DNA拼接起來的酶類 ? 原核生物主要有兩種類型的 DNA連接酶：E． coli DNA連接酶和 T4 DNA 連接酶。 ? ③ cDNA克隆中的第二鏈 cDNA的合成。 ? 克隆載體能攜帶外源 DNA片段進入受體細胞，或停留在細胞質中進行自我復制；或整合到染色體DNA、線粒體 DNA和葉綠體 DNA中，隨這些DNA同步復制。 1．具有復制起點 2．具有抗菌素抗性基因 3．具有若干限制酶單一識別位點 4．具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù) 四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素 抗性基因O r i P s t Ⅰ S a l ⅠP v u ⅡA v a ⅠB a m H ⅠH in d ⅢE c o R Ⅰp B R 32 2( a m pr)( t e rr)pBR322質粒載體的優(yōu)點： 具有較小的分子量； 它的分子量為 4363bp。 ? ②適用于組織化學方法檢測重組體。 噬菌體載體 ? 噬菌體顆粒的外殼是蛋白質，內部是核酸。 ? 前者凡有外源 DNA插入的 λ重組體都能形成清晰的噬菌斑 ? 后者形成無色 (淺藍色 )的噬菌斑 ? 2．置換型載體 ? 在 λ載體非必要區(qū)的兩側含有核酸限制性內切酶兩個切點，兩個切點間的片段被取代后不影響噬菌體生活力的載體。 ? 核酸分子探針是指能與互補核酸系列復性雜交的特定已知核苷酸片斷。如 DNA分子中某段的 G≡C堿基對含量高，則其熱穩(wěn)定性就高，即其熔解溫度 (Tm)值就高。 ? cDNA：具有與某 RNA鏈呈互補的堿基序列的單鏈 DNA即 plementary DNA之縮寫，或此 DNA鏈與具有與之互補的堿基序列的 DNA鏈所形成的 DNA雙鏈。 ? 通過 PCR技術獲取所需要的特異 DNA片段在實際應用用得非常多，但是前提條件是必須對目的基因有一定的了解，需要設計引物。 平末端連接 （ 2）同聚物加尾連接平末端 DNA片段 運用末端核苷酸轉移酶，能夠將核苷酸 (通過脫氧核苷三磷酸前體 )，加到 DNA分子單鏈延伸末端的 3， 一 OH基團上，它并不需要模板鏈的存在，它一個一個加上核苷酸，構成由核苷酸組成的尾巴，長度可達 100個核苷酸。為了解決這個問題，可采用銜接物法提供必要的序列，進行DNA分子的連接。當它的平末端與平末端的外源 DNA片段連接之后，便會使后者成為具粘性末端的新的 DNA分子，而易于連接重組。 ? 1． CaCl2處理后的細菌轉化或轉染。通過調節(jié)外加電場的強度、電脈沖的長度和用于轉化的 DNA濃度可將外源 DNA導入細菌或真核細胞。通過帶有多拷貝重組質粒的細菌原生質體同培養(yǎng)的哺乳細胞直接融合。 1．菌落印跡原位雜交 ? 將被篩選的菌落或噬菌斑，從其生長的瓊脂平板中通過影印方法，小心地原位轉移到放在瓊脂平板表面的硝酸纖維素濾膜上，并保存好原來的菌落或噬菌斑平板作為參照。 (二 )核酸雜交法 3． Southern印跡雜交 ? 它首先將初篩的重組 DNA提取出來，用合適的核酸限制性內切酶將 DNA切割，并進行凝膠電泳分離，然后經(jīng)堿變性，利用干燥的吸水紙產(chǎn)生的毛細作用，讓液體流經(jīng)凝膠，使 DNA片段由液流攜帶，從凝膠轉移并結合在硝酸纖維素濾膜的表面，最后將此膜同標記的核酸探針進行分子雜交。在臨近雙鏈 DNA的變性溫度下和高濃度 (70％ )的甲酰胺溶液中，雙鏈的 DNA—RNA分子要比雙鏈的 DNA—DNA分子更為穩(wěn)定。 ?基因的人工定點突變。載體一般帶有必要的標志基因，以便進行檢測。 作 業(yè) ? 基因工程的定義、研究內容 ? 基因工程研究的理論依據(jù)是什么？ ? 基因工程的工具酶有哪些？其作用是什么？ ? 基因工程的載體有哪些？載體的功能有哪些？ ? Southern雜交、 Northern雜交的概念是什么？ ? PCR技術的概念、原理及步驟 ? 目的基因的制備方法有哪些？ ? 目的基因與載體重組過程中平末端連接方式有哪幾種？ 第三章 蛋白質工程 Protein Engineering 167。 蛋白質的分子結構可劃分為一級結構、二級結構、三級結構和四級結構，這種結構由各種化學鍵組成。 α 螺旋和β 折疊是蛋白質構象的重要單元。這種在二級結構基礎上的肽鏈再折疊，稱為蛋白質的三級結構。四級結構中的聚合物，大致可分為不對稱性的聚合物和對稱性的聚合物。 目前，在化學結構和空間結構已經(jīng)闡明的酶蛋白，其酶分子的活性中心與底物結合時，整個酶分子的立體構象有所扭動，這種扭動引起的張力正是促使底物化學鍵容易發(fā)生斷裂的基本原因。 蛋白質工程的基本內容和目的可以概括為：以蛋白質結構與功能為基礎，通過化學和物理手段，對目標基因按預期設計進行修飾和改造，合成新的蛋白質；對現(xiàn)有的蛋白質加以定向改造、設計、構建和最終生產(chǎn)出比自然界存在的蛋白質功能更優(yōu)良，更符合人類需求的功能蛋白質。 按照目的蛋白質分子的改進或構建方案 ， 進行編碼該蛋白質基因的修飾和合成 ， 再通過遺傳工程途徑 ， 在適當?shù)妮d體表達系統(tǒng)中表達所需要的蛋白質 。 32蛋白質工程的工作定義 ? 建立蛋白質工程的研究方法系統(tǒng) ? 隨機誘變基因庫的定向篩選 ? 研究蛋白質結構與功能的關系 ? 嚴格意義上的蛋白質工程 ? 在研究某些蛋白質一級結構及其結構功能元件相互關系的基礎上建立起應用蛋白質工程方法的系統(tǒng)。 單晶體衍射法是研究蛋白質空間結構最主要的分析手段，分別用于對結晶蛋白質，單晶體衍射主要對結晶蛋白質的各向基團的空間排布進行分析，對蛋白質分子的整體空間構架研究作用很大。 34蛋白質工程的應用 通過基因定點突變或基因克隆的方法 ， 人們就可以對自然界存在的酶或蛋白質進行改造 ， 使它們變成適合于工業(yè)化生產(chǎn)的新酶 。通過 PCR定向誘變技術，研究人員將第 14位和第 78位上的兩個天門冬酰胺分別轉變成蘇氨酸和異亮氨酸殘基，大幅度提高突變酶的熱穩(wěn)定性。 當活性中心內的谷氨酸和天門冬氨酸殘基分別被具有相反電荷或中性的氨基酸殘基（組氨酸、谷氨酰胺或天門冬酰胺）取代時，將導致突變體酶裂解 α－ 1， 4糖苷鍵與 α－ 1， 6糖苷鍵的活性比例發(fā)生明顯改變。 本身就是一段 RNA，不需要額外的蛋白酶就可以對自身進行剪切。實際上有了酶的固定化技術，酶在工業(yè)生產(chǎn)中的利用價值才真正得以體現(xiàn)。 167。一般采用淀粉及其水解產(chǎn)物，如糊精、麥芽糖等 ? 2．氮源，能夠向細胞提供氮素的化合物稱為氮源。 ? (二 )酶合成的阻遏物 ? 微生物酶的生產(chǎn)受代謝途徑末端產(chǎn)物和分解代謝產(chǎn)物的阻遏。 167。 ? 2． pH 在提純過程中通常采用一定