【正文】 斑或菌落，再經(jīng)過擴(kuò)增，提取其中的重組體，最后即可獲得所需要的目的基因片段。 ? PCR法 PCR擴(kuò)增法 黏性末端連接 平段連接 由同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割的不同 DNA 片段具有完全相同的末端； 由兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割的 DNA片段具有相同類型的黏性末端； 黏性末端連接 ? 如果目的基因的 DNA片段是用限制性內(nèi)切酶切割并有 黏性末端 ，則用同一種限制性內(nèi)切酶處理載體 DNA，使其成為黏性末端。 ? 優(yōu)點(diǎn) 在于：①不易自身環(huán)化，這是因?yàn)橥环NDNA分子兩端的尾巴是相同的，所以不存在自身環(huán)化。 ? 所謂銜接物 (linker)，是指用化學(xué)方法合成的一段由10—12個核苷酸組成的、具有一個或數(shù)個限制酶識別位點(diǎn)的寡核苷酸片段。 平末端連接 導(dǎo)入方法 ? 1． CaCl2處理后的細(xì)菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。這是將重組的質(zhì)?；蚴删w DNA導(dǎo)入細(xì)菌中所用的常規(guī)方法，前者叫轉(zhuǎn)化 (transformation)后者叫轉(zhuǎn)染 (transfection)。用電穿孔法實(shí)現(xiàn)基因?qū)氡?CaCl2法方便，對細(xì)菌而言其轉(zhuǎn)化效率可達(dá) 109～ 1010轉(zhuǎn)化體／微克 DNA，但必須有專門儀器 導(dǎo)入方法 ? 3．聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。經(jīng)過細(xì)胞膜融合，細(xì)菌內(nèi)容物轉(zhuǎn)入動物細(xì)胞質(zhì)中，質(zhì)粒DNA被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。將影印的硝酸纖維素濾膜，用堿液處理，促使細(xì)菌細(xì)胞壁原位裂解、釋放出 DNA并隨之原位變性。如果被檢測 DNA片段與核酸探針具有互補(bǔ)序列，就能在被檢測 DNA的條帶部位結(jié)合成雙鏈的雜交分子，并通過放射自顯影顯示出黑色條帶來。因此，當(dāng) RNA探針及待測 DNA的混合物置于這種退火條件下， RNA便會同它的購 DNA分子中的互補(bǔ)序列退火形成穩(wěn)定的 DNA—RNA雜交分子，而使被取代的 DNA鏈處于單鏈狀態(tài)。 ?人類基因組計(jì)劃 ? 基因工程是一項(xiàng)非常復(fù)雜的技術(shù)操作，它的環(huán)節(jié)之繁多、操作之細(xì)致是其他工程所無法比擬的。 ? (3)重組 DNA，即用人工方法，讓目的基因與運(yùn)載體相結(jié)合，首先要用限制性內(nèi)切酶和其他一些酶類，切割或修飾載體 DNA和目的基因，然后用連接酶將兩者連接起來，使目的基因插入載體內(nèi)，形成重組 DNA分子。 31蛋白結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和蛋白質(zhì)工程的原理 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本構(gòu)件 在自然界中，構(gòu)成生命最基本的物質(zhì)有蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂類等生物大分子，其中蛋白質(zhì)最為重要，核酸則最為根本。蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象又稱為空間結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)、立體結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)等等，是指蛋白質(zhì)分子中所有原子在三維空間的擺布情況規(guī)律。二級結(jié)構(gòu)不涉及氨基酸殘基的側(cè)鏈構(gòu)象。 維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力有四種共價鍵類型： ① R基之間的氫鍵； ② 非極性 R基之間的疏水基相互作用 （ 范德華引力 ） ； ③ α 螺旋和 β 折疊中的肽鏈內(nèi)或肽鏈間德氫鍵；④ 帶正負(fù)電荷的 R基之間的離子鍵 。構(gòu)成四級結(jié)構(gòu)的原體可排列成二聚體、三聚體、四聚體、五聚體，最多可聚合成六十聚體等。這種張力也是依靠酶分子中的許多非活性中心部位的協(xié)調(diào)作用而發(fā)生的。 嚴(yán)格地說蛋白質(zhì)工程就是以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究為基礎(chǔ)，運(yùn)用遺傳工程的方法，借助計(jì)算機(jī)信息處理技術(shù)的支持，從改變和合成基因入手，定向地改造天然蛋白質(zhì)或設(shè)計(jì)全新的人工蛋白質(zhì)分子，使之具有特定的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，能更好地為人類服務(wù)的一種生物技術(shù)。 通過這一過程的重復(fù)進(jìn)行 ，最終符合目的蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu) 、 性質(zhì)和功能設(shè)計(jì)的要求 。 ? 利用目的基因表型具有高效檢測篩選系統(tǒng)這一特性，在目標(biāo)條件下從隨機(jī)誘變基因庫中分離出目標(biāo)基因，最終獲得突變蛋白質(zhì)。 一般來說提高蛋白的穩(wěn)定性包括以下幾個方面：①延長酶的半衰期；②提高酶的熱穩(wěn)定性；③延長藥用蛋白質(zhì)的保存期；④抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失。 通過對蛋白質(zhì) 中非必需的天門冬酰胺進(jìn)行突變，有利于提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。 修飾 Nisin的生物防腐效應(yīng) (Nisin)乳酸鏈球菌素，是一種乳酸鏈球菌在代謝過程中合成和分泌的有較強(qiáng)抑菌作用的小分子肽，是目前研究最多，應(yīng)用最廣，由乳酸菌產(chǎn)生的唯一能應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)的細(xì)菌素。 ? 高效率 比非催化高 108－ 1020倍 比非酶催化高 107－ 1013倍 ? 高度專一性 ? 反應(yīng)條件溫和 ? 酶催化是可調(diào)控的 ? 酶工程 ? (enzyme engineering)即利用酶的催化作用，在一定的生物反應(yīng)器中，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成所需的產(chǎn)品。 生命活動過程中的新陳代謝所涉及的各種 化學(xué)反應(yīng)由各種酶的催化來實(shí)現(xiàn)。 42 酶的生物發(fā)酵生產(chǎn) – 發(fā)酵法 ? 利用細(xì)胞，主要是微生物細(xì)胞的生命活動而獲得所需的酶。氮源分為有機(jī)氮和無機(jī)氮。例如，枯草桿菌堿性磷酸酶的合成受其催化產(chǎn)物無機(jī)磷酸的抑制 ? ① 產(chǎn)酶效率高 ，細(xì)胞被固定化后，只能在一定的空間范圍內(nèi)生長繁殖，細(xì)胞密度增大，故可加快生化反應(yīng)速度，提高產(chǎn)酶率。 43 酶的分離純化 ? ? ①首先獲得出發(fā)酶液。 保藏菌種 ?活化 ?擴(kuò)培 ?發(fā)酵 ?分離純化 ?成品 (酶 ) 固體發(fā)酵 液體發(fā)酵 一般工藝流程： ? 1．溫度操作過程盡可能在低溫 (０ ― ４ ℃ )下進(jìn)行，溶液中存在無機(jī)鹽或有機(jī)溶劑時，更應(yīng)如此，以防止蛋白質(zhì)水解酶對目的酶的分解破壞。 ? (三 )溶解氧 ? 在發(fā)酵過程中應(yīng)連續(xù)不斷地供給無菌空氣，同時進(jìn)行攪拌以增加培養(yǎng)基中溶解氧的含量。誘導(dǎo)物多為底物或底物類似物，如淀粉、蔗糖、纖維素分別是淀粉酶、蔗糖酶、纖維素酶的誘導(dǎo)物。 ? 一、菌種的活化和擴(kuò)大培養(yǎng) ? (一 )菌種活化 ? (二 )菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) ? 二、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備 ? 1．碳源，碳源是指能向細(xì)胞提供碳素的含碳化合物。 ? 例如，從動物胰臟中提取胰酶；從動物胃中提取胃蛋白酶等 。 其中固定化酶技術(shù)是酶工程的核心。 41酶工程原理和方法 酶是由生物體產(chǎn)生的具有催化劑活性的蛋白質(zhì) 。借助定點(diǎn)突變技術(shù)，研究人員確定了嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)生的新支鏈淀粉酶的活性中心。這種酶有兩個相同的亞基，每個亞基含有兩個天門冬酰胺，它們都位于亞基之間的界面上，對酶的熱穩(wěn)定性起決定性作用。 167。 167。同時計(jì)算機(jī)輔助處理系統(tǒng)可以通過生物物理學(xué)原理 ， 模擬預(yù)測氨基酸序列的變化對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的影響 。這是新一代的基因工程，因而蛋白質(zhì)工程也稱為第二代基因工程。 一般來說 ， 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系包含著兩個方面的問題： ① 蛋白質(zhì)必須具備特定的結(jié)構(gòu) ， 才能表現(xiàn)特定的功能 ， 在蛋白質(zhì)肽鏈中有一些基團(tuán)對特定功能而言是必需基團(tuán) ， 另一些是非必需基團(tuán)；② 在體內(nèi) ， 蛋白質(zhì)分子是如何利用它的特定結(jié)構(gòu)執(zhí)行特定的生物功能的 。 維持四級結(jié)構(gòu)的主要力靠疏水鍵。環(huán)球蛋白是在三維空間中沿著多方向進(jìn)行卷曲、折疊、盤繞而成的近似球形結(jié)構(gòu)。如 α 螺旋、 β 折疊和β 轉(zhuǎn)角等。 從蛋白質(zhì)水解物中分離出來的氨基酸有 20種 ， 除了脯基酸外 ， 所有的氨基酸均可用下式表示： R （ NH2— CH— COOH） 一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基縮合失去一分子水，形成酰胺鍵，這種氨基酸之間連接的酰胺鍵又稱為肽鍵，一般由三個或三個以上的氨基酸殘基組成的肽稱為多肽。“收獲”工作比較復(fù)雜，這里不再介紹。用人工方法，取得目的基因的適宜的載體，即質(zhì)?；虿《?。 一、基礎(chǔ)理論研究： ?基因的結(jié)構(gòu)與功能。 (二 )R環(huán)檢測法 :采用 mRNA作探針，利用電子顯微鏡觀察其核酸雜交結(jié)果。此方法常用于病毒核酸的定量檢測。而采用 DNA分子雜交的方法，只能在被雜交的 DNA中存在目的基因的一部分 DNA序列，就會出現(xiàn)雜交信號。 導(dǎo)入方法 ? 5．原生質(zhì)體融合。 導(dǎo)入方法 ? 2．高壓電穿孔法。 ? 7．細(xì)胞核的顯微注射法。它是一類由人工合成的一頭具有某種限制性內(nèi)切酶粘末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸片段。 ? (3) 用銜接物連接平末端 DNA分子 ? 如果重組體 DNA是用 T4DNA連接酶的平末端連接或是用同聚物加尾構(gòu)建的，那么就無法用原來的限制酶作特異的切割，因此也不能獲得插入 DNA片段。 且外源 DNA不能原位刪除下來。 基因的化學(xué)合成 ? 2．基因的化學(xué)一酶促合成： ? 此方法的特點(diǎn)是不需要合成組成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是合成其中一些片段，相鄰的 3’－末端有一短的順序相互補(bǔ)，在適當(dāng)?shù)臈l件下通過退火形成模板－引物的復(fù)合體 (templateprimer plex)，然后在存在四種 dNTP的條件下，用E． coli的 DNA聚合酶 I大片段 (Klenow片段 )去填補(bǔ)互補(bǔ)片段之間的缺口，最后用 T4DNA連接酶連接及適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割后重組入載體 (圖 145)。 ? 直接從基因組中分離目的基因的方法 ? 基因組文庫法 ? 以適當(dāng)?shù)哪康幕蚱巫魈结?，利用高密度的噬菌斑或菌落原位雜交技術(shù)，從大量的噬菌斑或菌落中篩選出含有目的基因的重組體的噬菌斑或菌落，再經(jīng)過擴(kuò)增，提取其中的重組體，最后即可獲得所需要的目的基因片段。 ? 外源基因 （ Foreign gene）：插入到載體內(nèi)的非自身的 DNA片段 ? 基因化學(xué)合成法 ? 基因生物制備法 DNA自動合成儀 ? cDNA文庫法 ? PCR法 ? 基因組文庫法 ? 基因分離的物理化學(xué)方法 ? 鳥槍法 (shot gun) ? cDNA文庫的建立與基因的分離 ? 直接從特定的 mRNA分離基因 ? 基因組文庫的建立和基因的分離 ? 從蛋白質(zhì)人手分離編碼此蛋白的基因 ? 基因化學(xué)合成法 ? 利用 PCR法或 RTPCR分離基因 基因分離的物理化學(xué)方法 ? 根據(jù) DNA分子的兩條鏈存在著 G≡C、 A=T(分別代表 GC間的三個氫鍵、 AT間二個氫鍵 )堿基配對。 ? 3．具有高容量的克隆能力 ? 柯斯質(zhì)粒載體的克隆極限可達(dá) 45kb左右 ? 核酸分子探針的標(biāo)記 ? 核酸分子的雜交 ? 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 核酸分子探針的標(biāo)記 ? 探針是指在化學(xué)及生物學(xué)意義上能與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用，并可被特殊的方法所測定的分子。 λ噬菌體載體的類型 ? 1．插入型載體 ? 插入型的 λ載體又分免疫功能失活和大腸桿菌 β半乳糖苷酶失活兩種亞型。 ? 噬菌體是一類細(xì)菌病毒的總稱。 ? ①具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。 質(zhì)粒載體的條件 一種理想的用作克隆載體的質(zhì)粒必須滿足如下幾方面的條件。 (二 )分子克隆中常用的其他工具酶 ? 甲基化酶 ? 末端轉(zhuǎn)移酶 ? 堿性磷酸酶 ? 逆轉(zhuǎn)錄酶 ? S1核酸酶 ? Bal31植酸酶 載體的功能 ： ? 運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 ? 為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力 ? 為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件 ? Vector，本質(zhì)是 DNA ? 攜帶外源基因進(jìn)入到受體細(xì)胞的運(yùn)載工具 基因克隆載體具備條件 ? 在克隆載體合適的位置含有允許外源 DNA片段組入的克隆位點(diǎn)，并且這樣的克隆位點(diǎn)應(yīng)盡可能的多。 ? ②對具有 3’隱蔽末端的 DNA片段作放射性末端標(biāo)記。 ? 同裂酶指來源不同、而識別序列和切割方式均相同的核酸內(nèi)切酶。 基因工程的基本過程就是利用重組 DNA（ rebinant DNA）技術(shù)，在體外通過人工“剪切（ cut）”和“拼接（ splice）”等方法，對生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行增殖，并使重組基因在受體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類需要的基因。 ? 主要包括酶的固定化技術(shù)、細(xì)胞固定化技術(shù)、酶的修飾改造技術(shù)及酶反應(yīng)器的設(shè)計(jì)技術(shù)等。即按照人們的需要，用類似工程設(shè)計(jì)的方法將不同來源的基因 (DNA 分子 )在體外構(gòu)建成雜種 DNA分子，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù) 制、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的操作，也稱 DNA重組技術(shù)。 ? 基因工程 (gene engineering) 是指在基因水平上的操作井改變生物遺傳特性的 技術(shù)。 酶工程 ? 利用酶、細(xì)胞器或細(xì)胞所具有的特異催化功能以及對酶進(jìn)行的修飾改造，并借助于生物反應(yīng)器生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品的一項(xiàng)技術(shù)。 生物工程發(fā)展的趨勢 ? 目前三個平臺： DNA重組、細(xì)胞培養(yǎng)和 DNA芯片 ? 未來將會形成的幾個新的平臺