【文章內容簡介】 lex)，然后在存在四種 dNTP的條件下，用E． coli的 DNA聚合酶 I大片段 (Klenow片段 )去填補互補片段之間的缺口，最后用 T4DNA連接酶連接及適當的限制性內切酶切割后重組入載體 (圖 145)。 ? 通過 PCR技術獲取所需要的特異 DNA片段在實際應用用得非常多，但是前提條件是必須對目的基因有一定的了解，需要設計引物。 ? PCR法 PCR擴增法 黏性末端連接 平段連接 由同一種限制性核酸內切酶切割的不同 DNA 片段具有完全相同的末端； 由兩種不同的限制性核酸內切酶切割的 DNA片段具有相同類型的黏性末端； 黏性末端連接 ? 如果目的基因的 DNA片段是用限制性內切酶切割并有 黏性末端 ，則用同一種限制性內切酶處理載體 DNA，使其成為黏性末端。切下的目的基因的片段插入到質粒的切口處，再加入適量的 DNA連接酶，質粒的黏性末端與目的基因 DNA片段的黏性末端就會因堿基互補配對而結合，形成一個重組DNA分子。 平末端連接 連接平末端 DNA分子的方法有 4種： （ 1）直接用 T4DNA連接酶連接； （ 2）先用 末端核苷酸轉移酶 ，給平末端 DNA分子加上同聚物尾巴之后再用 DNA連接酶進行連接； （ 3）用銜接物連接平末端 DNA分子； （ 4） DNA接頭連接法。 （ 1）直接用 T4DNA連接酶連接 平末端連接 （ 1） T4DNA連接酶除了能夠封閉具有 3， 一OH和 5’一 P末端的雙鏈 DNA的缺口之外，在存在 ATP和加入高濃度酶（ 10100倍） 和低濃度的聚乙二醇 PEG8000存在的條件下，它還能夠連接具有完全堿基配對的平末端的DNA分子。這種反應的原因目前尚不清楚。但平末端連接效率不高，基因操作不經常采用。 且外源 DNA不能原位刪除下來。 平末端連接 （ 2）同聚物加尾連接平末端 DNA片段 運用末端核苷酸轉移酶，能夠將核苷酸 (通過脫氧核苷三磷酸前體 )，加到 DNA分子單鏈延伸末端的 3， 一 OH基團上，它并不需要模板鏈的存在，它一個一個加上核苷酸，構成由核苷酸組成的尾巴，長度可達 100個核苷酸。 ? 優(yōu)點 在于：①不易自身環(huán)化，這是因為同一種DNA分子兩端的尾巴是相同的，所以不存在自身環(huán)化。②因為載體和外源片段的末端是互補的黏性末端，所以連接效率較高。③用任何一種方法制備的 DNA片段都可以用這種方法進行連接。 ? 同聚物加尾法的 不足 之處：①方法煩瑣；②外源片段難以回收。另外．由于添加了許多同聚物的尾巴，可能會影響外源基因的表達。還要注意的是，同聚物加尾法同平末端連接法一樣，重組連接后往往會重新產生某種核酸限制性內切酶的切點。 ? (3) 用銜接物連接平末端 DNA分子 ? 如果重組體 DNA是用 T4DNA連接酶的平末端連接或是用同聚物加尾構建的，那么就無法用原來的限制酶作特異的切割，因此也不能獲得插入 DNA片段。為了解決這個問題，可采用銜接物法提供必要的序列，進行DNA分子的連接。 ? 所謂銜接物 (linker)，是指用化學方法合成的一段由10—12個核苷酸組成的、具有一個或數個限制酶識別位點的寡核苷酸片段。 平末端連接 ? 銜接物的 5， －末端和待克隆的 DNA片段 5， —末端，用 多核苷酸激酶 處理使之磷酸化，然后再通過 T4DNA連接酶的作用使兩者連接起來。接著用適當的限制酶消化具有銜接物的 DNA分子和克隆載體分子，這樣的結果使二者都產生出了彼此互補的粘性末端。于是便可以按照常規(guī)的粘性末端連接法，將待克隆的 DNA片段同載體分子連接起來 平末端連接 （ 4） DNA接頭連接法 ? DNA銜接物連接法盡管有諸多方面的優(yōu)越性，但也有一個明顯的缺點，那就是如果待克隆的 DNA片段或基因的內部，也含有與所加的銜接物相同的限制位點，這樣在酶切消化銜接物產生粘性末端的同時，也就會把克隆基因切成不同的片段，從而為后繼的亞克隆及其它操作造成麻煩。 ? 當然，在遇到這種情況時，一個方法可改用其它類型的銜接物，另一種公認的較好的替代辦法是改用DNA接頭 (adapter)連接法。 平末端連接 ? DNA接頭 (adapter)連接法于 1978年由康乃爾大學吳瑞教授發(fā)明的。它是一類由人工合成的一頭具有某種限制性內切酶粘末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸片段。當它的平末端與平末端的外源 DNA片段連接之后，便會使后者成為具粘性末端的新的 DNA分子，而易于連接重組。 平末端連接 導入方法 ? 1． CaCl2處理后的細菌轉化或轉染。 ? 2．高壓電穿孔法。 ? 3．聚乙二醇介導的原生質體轉化法。 ? 4．磷酸鈣或 DEAE葡聚糖介導的轉染。 ? 5．原生質體融合。 ? 6．脂質體法。 ? 7．細胞核的顯微注射法。 ? 1． CaCl2處理后的細菌轉化或轉染。這是將重組的質粒或噬菌體 DNA導入細菌中所用的常規(guī)方法，前者叫轉化 (transformation)后者叫轉染 (transfection)。作為受體細胞的細菌經一定濃度的冰冷 CaCl2(50100mmol／ L)溶液處理后變成所謂感受態(tài)細胞(Competent cells)處在感受態(tài)的菌體有攝取各種外源 DNA的能力。 導入方法 ? 注意以下幾點： (a)用作受體菌的細胞在培養(yǎng)時要掌握好細胞密度，一般在 OD 600為0． 4左右為好。 (b)制備受體細胞的整個過程要在０～ 4℃ 進行，并盡量避免污染。如果用抗菌素篩選轉化體，作為對照的受體菌應該在此培養(yǎng)基上不生長。 (c)為了提高轉化率，可選用復合 CaCl2溶液如“分子克隆”一書所介紹的 FSB溶液。 導入方法 ? 2．高壓電穿孔法。通過調節(jié)外加電場的強度、電脈沖的長度和用于轉化的 DNA濃度可將外源 DNA導入細菌或真核細胞。用電穿孔法實現基因導入比 CaCl2法方便，對細菌而言其轉化效率可達 109～ 1010轉化體／微克 DNA，但必須有專門儀器 導入方法 ? 3．聚乙二醇介導的原生質體轉化法。這種方法常用于轉化酵母細胞以及其它真菌細胞?；钴S生長的細胞或菌絲體用消化細胞壁的酶 (如 driselase)處理變成球形體后，在適當濃度的聚乙二醇 6000(PEG一 6000)的介導下將外源 DNA轉化入受體細胞中。 導入方法 ? 4．磷酸鈣或 DEAE葡聚糖介導的轉染。這是將外源基因導入哺乳類細胞中進行瞬時表達的常規(guī)方法。用磷酸鈣和 DNA共沉淀方法時是將被轉染的 DNA同正在溶液中形成的磷酸鈣微粒共沉淀后可能通過內吞作用進入受體細胞。 導入方法 ? 5．原生質體融合。通過帶有多拷貝重組質粒的細菌原生質體同培養(yǎng)的哺乳細胞直接融合。經過細胞膜融合，細菌內容物轉入動物細胞質中，質粒DNA被轉移到細胞核中。 ? 6．脂質體法。將 DNA或 RNA包裹于脂質體內，然后進行脂質體與細胞膜融合將基因導入。 ? 7．細胞核的顯微注射法。即將目的基因重組體通過顯微注射裝置直接注入細胞核中。 導入方法 篩選和鑒定 遺傳檢測 目的基因轉錄產物檢測 目的基因翻譯產物檢測 物理檢測法 核酸分析法 一 、 遺傳檢測 根據載體表型特征的篩選 根據插入基因遺傳性狀的篩選 抗藥性標記 β —半乳糖苷酶 顯色反應 二、核酸分析法 (一 ) PCR法 (二 )核酸雜交法 (三 )DNA測序法 菌落印跡原位雜交 斑點印跡雜交 Southern印跡雜交 (一 )PCR法 ? 根據含目的基因兩端或兩側已知核苷酸序列，設計合成一對引物，以待鑒定的克隆子的總 DNA為模板進行擴增，若獲得特異性擴增 DNA片段，表明待鑒定的克隆子含有目的基因。而采用 DNA分子雜交的方法，只能在被雜交的 DNA中存在目的基因的一部分 DNA序列，就會出現雜交信號。 1．菌落印跡原位雜交 ? 將被篩選的菌落或噬菌斑，從其生長的瓊脂平板中通過影印方法，小心地原位轉移到放在瓊脂平板表面的硝酸纖維素濾膜上，并保存好原來的菌落或噬菌斑平板作為參照。將影印的硝酸纖維素濾膜，用堿液處理，促使細菌細胞壁原位裂解、釋放出 DNA并隨之原位變性。然后 80℃ 下烘烤濾膜，使變性 DNA原位同硝酸纖維素濾膜形成不可逆的結合。將這塊固定有 DNA印跡的濾膜干燥后，同放射性標記的特異性 DNA或 RNA探針雜交，漂洗除去多余的探針，最后經放射自顯影檢測雜交的結果。含有同探針序列同源的DNA的印跡，在 x光底片上呈現黑色的斑點，將膠片同原先保存的參照平板進行對照，即可確定陽性菌落或噬菌斑的位置，從而獲得含有目的基因插入片段的重組礎工業(yè)體克隆。 (二 )核酸雜交法 2．斑點印跡雜交 ? 斑點印跡雜交法與菌落印跡原位雜交的原理一樣，但方法更簡單、迅速，可直接將噬菌體的上清液或是由轉化子提取的DNA(RNA)樣品直接點在硝酸纖維素濾膜等固體支持物上，然后同核酸探針進行分子雜交。通過放射自顯影，從底片中找出黑點即為陽性斑點。此方法常用于病毒核酸的定量檢測。 (二 )核酸雜交法 3． Southern印跡雜交 ? 它首先將初篩的重組 DNA提取出來，用合適的核酸限制性內切酶將 DNA切割，并進行凝膠電泳分離，然后經堿變性，利用干燥的吸水紙產生的毛細作用，讓液體流經凝膠，使 DNA片段由液流攜帶，從凝膠轉移并結合在硝酸纖維素濾膜的表面，最后將此膜同標記的核酸探針進行分子雜交。如果被檢測 DNA片段與核酸探針具有互補序列，就能在被檢測 DNA的條帶部位結合成雙鏈的雜交分子，并通過放射自顯影顯示出黑色條帶來。 (二 )核酸雜交法 (三 )DNA測序法 ? 進行目的基因的核苷酸測序。如果待測序的目的基因比較大，測序有困難，也可用 RFLP(限制性片段長度多態(tài)性 )技術。 ? 用限制性內切酶對待克隆的目的基因和已克隆的目的基因進行切割，若凝膠電泳結果不一致，可斷定克隆子中克隆的不是目的基因，或者克隆的目的基因的核苷酸序列已發(fā)生了變化。經多種限制性內切酶切割分析，若兩種結果都一樣，可認為克隆子中克隆的是原定的目的基因，其核苷酸序列沒有變化。 三、物理檢測法 (一 )凝膠電泳檢測法 (二 )R環(huán)檢測法 (一 )凝膠電泳檢測法 :利用凝膠電泳檢測重組質粒 DNA分子的大小，也可以初步證明外源目的基因片段是否已插入載體。 (二 )R環(huán)檢測法 :采用 mRNA作探針，利用電子顯微鏡觀察其核酸雜交結果。在臨近雙鏈 DNA的變性溫度下和高濃度 (70％ )的甲酰胺溶液中，雙鏈的 DNA—RNA分子要比雙鏈的 DNA—DNA分子更為穩(wěn)定。因此，當 RNA探針及待測 DNA的混合物置于這種退火條件下， RNA便會同它的購 DNA分子中的互補序列退火形成穩(wěn)定的 DNA—RNA雜交分子，而使被取代的 DNA鏈處于單鏈狀態(tài)。這種由單鏈 DNA分支和雙鏈 DNARNA分支形成的“泡狀”體，叫做 R環(huán)結構。 四、目的基因轉錄產物檢測 ? 用 RNA印跡 (Northern blotting)法檢測。根據轉錄的 RNA在一定條件下可以同轉錄該種 RNA的模板 DNA鏈進行雜交的特性，制備目的基因 DNA探針，變性后同克隆子總RNA雜交，若出現明顯的雜交信號，可以認定進入受體細胞的目的基因轉錄出相應的 mRNA。 五、目的基因翻譯產物檢測 ? 最常用的是蛋白質印跡 (Westernblotting)法。提取克隆子總蛋白質，經 SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳按分子大小分開后，轉移到供雜交用的膜上，隨后與放射性同位素或非放射性標記物標記的特異性抗體結合，通過一系列抗原抗體反應，在雜交膜上顯示出明顯的雜交信號，表明受體細胞中存在目的基因表達產物。 一、基礎理論研究： ?基因的結構與功能。 ?基因的人工定點突變。 ?人類基因組計劃 ? 基因工程是一項非常復雜的技術操作，它的環(huán)節(jié)之繁多、操作之細致是其他工程所無法比擬的。但是如果拋開細節(jié)問題，基因工程操作流程還是比較明了的。它的基本步驟可以大致歸納如下： 小結 ? （ 1）獲取目的基因，即用各種不同的方法取得人所需要的基因，也就是某些 DNA片段。那里面含有一種或幾種遺傳信息的全套遺傳密碼。獲取目的基因是基因工程操作的關鍵。 ? （ 2）獲取基因載體。用人工方法，取得目的基因的適宜的載體，即質?；虿《?。載體一般帶有必要的標志基因，以便進行檢測。 ? (3)重組 DNA，即用人工方法，讓目的基因與運載體相結合，首先要用限制性內切酶和其他一些酶類，切割或修飾載體 DNA和目的基因，然后用連接酶將兩者連接起來，使目的基因插入載體內，形成重組 DNA分子。這些工作都在生物體