【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 lex)，然后在存在四種 dNTP的條件下，用E． coli的 DNA聚合酶 I大片段 (Klenow片段 )去填補(bǔ)互補(bǔ)片段之間的缺口，最后用 T4DNA連接酶連接及適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割后重組入載體 (圖 145)。 ? 通過(guò) PCR技術(shù)獲取所需要的特異 DNA片段在實(shí)際應(yīng)用用得非常多，但是前提條件是必須對(duì)目的基因有一定的了解，需要設(shè)計(jì)引物。 ? PCR法 PCR擴(kuò)增法 黏性末端連接 平段連接 由同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割的不同 DNA 片段具有完全相同的末端； 由兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割的 DNA片段具有相同類型的黏性末端； 黏性末端連接 ? 如果目的基因的 DNA片段是用限制性內(nèi)切酶切割并有 黏性末端 ，則用同一種限制性內(nèi)切酶處理載體 DNA，使其成為黏性末端。切下的目的基因的片段插入到質(zhì)粒的切口處，再加入適量的 DNA連接酶，質(zhì)粒的黏性末端與目的基因 DNA片段的黏性末端就會(huì)因堿基互補(bǔ)配對(duì)而結(jié)合，形成一個(gè)重組DNA分子。 平末端連接 連接平末端 DNA分子的方法有 4種： （ 1）直接用 T4DNA連接酶連接； （ 2）先用 末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶 ，給平末端 DNA分子加上同聚物尾巴之后再用 DNA連接酶進(jìn)行連接； （ 3）用銜接物連接平末端 DNA分子； （ 4） DNA接頭連接法。 （ 1）直接用 T4DNA連接酶連接 平末端連接 （ 1） T4DNA連接酶除了能夠封閉具有 3， 一OH和 5’一 P末端的雙鏈 DNA的缺口之外，在存在 ATP和加入高濃度酶（ 10100倍） 和低濃度的聚乙二醇 PEG8000存在的條件下，它還能夠連接具有完全堿基配對(duì)的平末端的DNA分子。這種反應(yīng)的原因目前尚不清楚。但平末端連接效率不高，基因操作不經(jīng)常采用。 且外源 DNA不能原位刪除下來(lái)。 平末端連接 （ 2）同聚物加尾連接平末端 DNA片段 運(yùn)用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，能夠?qū)⒑塑账?(通過(guò)脫氧核苷三磷酸前體 )，加到 DNA分子單鏈延伸末端的 3， 一 OH基團(tuán)上，它并不需要模板鏈的存在，它一個(gè)一個(gè)加上核苷酸，構(gòu)成由核苷酸組成的尾巴，長(zhǎng)度可達(dá) 100個(gè)核苷酸。 ? 優(yōu)點(diǎn) 在于：①不易自身環(huán)化，這是因?yàn)橥环NDNA分子兩端的尾巴是相同的，所以不存在自身環(huán)化。②因?yàn)檩d體和外源片段的末端是互補(bǔ)的黏性末端，所以連接效率較高。③用任何一種方法制備的 DNA片段都可以用這種方法進(jìn)行連接。 ? 同聚物加尾法的 不足 之處：①方法煩瑣；②外源片段難以回收。另外．由于添加了許多同聚物的尾巴，可能會(huì)影響外源基因的表達(dá)。還要注意的是，同聚物加尾法同平末端連接法一樣，重組連接后往往會(huì)重新產(chǎn)生某種核酸限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)。 ? (3) 用銜接物連接平末端 DNA分子 ? 如果重組體 DNA是用 T4DNA連接酶的平末端連接或是用同聚物加尾構(gòu)建的，那么就無(wú)法用原來(lái)的限制酶作特異的切割，因此也不能獲得插入 DNA片段。為了解決這個(gè)問(wèn)題，可采用銜接物法提供必要的序列，進(jìn)行DNA分子的連接。 ? 所謂銜接物 (linker)，是指用化學(xué)方法合成的一段由10—12個(gè)核苷酸組成的、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸片段。 平末端連接 ? 銜接物的 5， －末端和待克隆的 DNA片段 5， —末端，用 多核苷酸激酶 處理使之磷酸化，然后再通過(guò) T4DNA連接酶的作用使兩者連接起來(lái)。接著用適當(dāng)?shù)南拗泼赶哂秀暯游锏?DNA分子和克隆載體分子，這樣的結(jié)果使二者都產(chǎn)生出了彼此互補(bǔ)的粘性末端。于是便可以按照常規(guī)的粘性末端連接法，將待克隆的 DNA片段同載體分子連接起來(lái) 平末端連接 （ 4） DNA接頭連接法 ? DNA銜接物連接法盡管有諸多方面的優(yōu)越性，但也有一個(gè)明顯的缺點(diǎn)，那就是如果待克隆的 DNA片段或基因的內(nèi)部，也含有與所加的銜接物相同的限制位點(diǎn)，這樣在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也就會(huì)把克隆基因切成不同的片段，從而為后繼的亞克隆及其它操作造成麻煩。 ? 當(dāng)然，在遇到這種情況時(shí)，一個(gè)方法可改用其它類型的銜接物，另一種公認(rèn)的較好的替代辦法是改用DNA接頭 (adapter)連接法。 平末端連接 ? DNA接頭 (adapter)連接法于 1978年由康乃爾大學(xué)吳瑞教授發(fā)明的。它是一類由人工合成的一頭具有某種限制性內(nèi)切酶粘末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸片段。當(dāng)它的平末端與平末端的外源 DNA片段連接之后，便會(huì)使后者成為具粘性末端的新的 DNA分子，而易于連接重組。 平末端連接 導(dǎo)入方法 ? 1． CaCl2處理后的細(xì)菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。 ? 2．高壓電穿孔法。 ? 3．聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。 ? 4．磷酸鈣或 DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。 ? 5．原生質(zhì)體融合。 ? 6．脂質(zhì)體法。 ? 7．細(xì)胞核的顯微注射法。 ? 1． CaCl2處理后的細(xì)菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。這是將重組的質(zhì)?；蚴删w DNA導(dǎo)入細(xì)菌中所用的常規(guī)方法，前者叫轉(zhuǎn)化 (transformation)后者叫轉(zhuǎn)染 (transfection)。作為受體細(xì)胞的細(xì)菌經(jīng)一定濃度的冰冷 CaCl2(50100mmol／ L)溶液處理后變成所謂感受態(tài)細(xì)胞(Competent cells)處在感受態(tài)的菌體有攝取各種外源 DNA的能力。 導(dǎo)入方法 ? 注意以下幾點(diǎn)： (a)用作受體菌的細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)要掌握好細(xì)胞密度，一般在 OD 600為0． 4左右為好。 (b)制備受體細(xì)胞的整個(gè)過(guò)程要在０～ 4℃ 進(jìn)行，并盡量避免污染。如果用抗菌素篩選轉(zhuǎn)化體，作為對(duì)照的受體菌應(yīng)該在此培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。 (c)為了提高轉(zhuǎn)化率，可選用復(fù)合 CaCl2溶液如“分子克隆”一書所介紹的 FSB溶液。 導(dǎo)入方法 ? 2．高壓電穿孔法。通過(guò)調(diào)節(jié)外加電場(chǎng)的強(qiáng)度、電脈沖的長(zhǎng)度和用于轉(zhuǎn)化的 DNA濃度可將外源 DNA導(dǎo)入細(xì)菌或真核細(xì)胞。用電穿孔法實(shí)現(xiàn)基因?qū)氡?CaCl2法方便，對(duì)細(xì)菌而言其轉(zhuǎn)化效率可達(dá) 109～ 1010轉(zhuǎn)化體／微克 DNA，但必須有專門儀器 導(dǎo)入方法 ? 3．聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。這種方法常用于轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞以及其它真菌細(xì)胞?；钴S生長(zhǎng)的細(xì)胞或菌絲體用消化細(xì)胞壁的酶 (如 driselase)處理變成球形體后，在適當(dāng)濃度的聚乙二醇 6000(PEG一 6000)的介導(dǎo)下將外源 DNA轉(zhuǎn)化入受體細(xì)胞中。 導(dǎo)入方法 ? 4．磷酸鈣或 DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。這是將外源基因?qū)氩溉轭惣?xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的常規(guī)方法。用磷酸鈣和 DNA共沉淀方法時(shí)是將被轉(zhuǎn)染的 DNA同正在溶液中形成的磷酸鈣微粒共沉淀后可能通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入受體細(xì)胞。 導(dǎo)入方法 ? 5．原生質(zhì)體融合。通過(guò)帶有多拷貝重組質(zhì)粒的細(xì)菌原生質(zhì)體同培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞直接融合。經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜融合，細(xì)菌內(nèi)容物轉(zhuǎn)入動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中，質(zhì)粒DNA被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。 ? 6．脂質(zhì)體法。將 DNA或 RNA包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進(jìn)行脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合將基因?qū)搿? ? 7．細(xì)胞核的顯微注射法。即將目的基因重組體通過(guò)顯微注射裝置直接注入細(xì)胞核中。 導(dǎo)入方法 篩選和鑒定 遺傳檢測(cè) 目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測(cè) 目的基因翻譯產(chǎn)物檢測(cè) 物理檢測(cè)法 核酸分析法 一 、 遺傳檢測(cè) 根據(jù)載體表型特征的篩選 根據(jù)插入基因遺傳性狀的篩選 抗藥性標(biāo)記 β —半乳糖苷酶 顯色反應(yīng) 二、核酸分析法 (一 ) PCR法 (二 )核酸雜交法 (三 )DNA測(cè)序法 菌落印跡原位雜交 斑點(diǎn)印跡雜交 Southern印跡雜交 (一 )PCR法 ? 根據(jù)含目的基因兩端或兩側(cè)已知核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，以待鑒定的克隆子的總 DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，若獲得特異性擴(kuò)增 DNA片段，表明待鑒定的克隆子含有目的基因。而采用 DNA分子雜交的方法，只能在被雜交的 DNA中存在目的基因的一部分 DNA序列，就會(huì)出現(xiàn)雜交信號(hào)。 1．菌落印跡原位雜交 ? 將被篩選的菌落或噬菌斑，從其生長(zhǎng)的瓊脂平板中通過(guò)影印方法，小心地原位轉(zhuǎn)移到放在瓊脂平板表面的硝酸纖維素濾膜上，并保存好原來(lái)的菌落或噬菌斑平板作為參照。將影印的硝酸纖維素濾膜，用堿液處理，促使細(xì)菌細(xì)胞壁原位裂解、釋放出 DNA并隨之原位變性。然后 80℃ 下烘烤濾膜，使變性 DNA原位同硝酸纖維素濾膜形成不可逆的結(jié)合。將這塊固定有 DNA印跡的濾膜干燥后，同放射性標(biāo)記的特異性 DNA或 RNA探針雜交，漂洗除去多余的探針，最后經(jīng)放射自顯影檢測(cè)雜交的結(jié)果。含有同探針序列同源的DNA的印跡，在 x光底片上呈現(xiàn)黑色的斑點(diǎn)，將膠片同原先保存的參照平板進(jìn)行對(duì)照，即可確定陽(yáng)性菌落或噬菌斑的位置，從而獲得含有目的基因插入片段的重組礎(chǔ)工業(yè)體克隆。 (二 )核酸雜交法 2．斑點(diǎn)印跡雜交 ? 斑點(diǎn)印跡雜交法與菌落印跡原位雜交的原理一樣，但方法更簡(jiǎn)單、迅速，可直接將噬菌體的上清液或是由轉(zhuǎn)化子提取的DNA(RNA)樣品直接點(diǎn)在硝酸纖維素濾膜等固體支持物上，然后同核酸探針進(jìn)行分子雜交。通過(guò)放射自顯影，從底片中找出黑點(diǎn)即為陽(yáng)性斑點(diǎn)。此方法常用于病毒核酸的定量檢測(cè)。 (二 )核酸雜交法 3． Southern印跡雜交 ? 它首先將初篩的重組 DNA提取出來(lái)，用合適的核酸限制性內(nèi)切酶將 DNA切割，并進(jìn)行凝膠電泳分離，然后經(jīng)堿變性，利用干燥的吸水紙產(chǎn)生的毛細(xì)作用，讓液體流經(jīng)凝膠，使 DNA片段由液流攜帶，從凝膠轉(zhuǎn)移并結(jié)合在硝酸纖維素濾膜的表面，最后將此膜同標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行分子雜交。如果被檢測(cè) DNA片段與核酸探針具有互補(bǔ)序列，就能在被檢測(cè) DNA的條帶部位結(jié)合成雙鏈的雜交分子，并通過(guò)放射自顯影顯示出黑色條帶來(lái)。 (二 )核酸雜交法 (三 )DNA測(cè)序法 ? 進(jìn)行目的基因的核苷酸測(cè)序。如果待測(cè)序的目的基因比較大，測(cè)序有困難，也可用 RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 )技術(shù)。 ? 用限制性內(nèi)切酶對(duì)待克隆的目的基因和已克隆的目的基因進(jìn)行切割，若凝膠電泳結(jié)果不一致，可斷定克隆子中克隆的不是目的基因，或者克隆的目的基因的核苷酸序列已發(fā)生了變化。經(jīng)多種限制性內(nèi)切酶切割分析，若兩種結(jié)果都一樣，可認(rèn)為克隆子中克隆的是原定的目的基因，其核苷酸序列沒(méi)有變化。 三、物理檢測(cè)法 (一 )凝膠電泳檢測(cè)法 (二 )R環(huán)檢測(cè)法 (一 )凝膠電泳檢測(cè)法 :利用凝膠電泳檢測(cè)重組質(zhì)粒 DNA分子的大小，也可以初步證明外源目的基因片段是否已插入載體。 (二 )R環(huán)檢測(cè)法 :采用 mRNA作探針，利用電子顯微鏡觀察其核酸雜交結(jié)果。在臨近雙鏈 DNA的變性溫度下和高濃度 (70％ )的甲酰胺溶液中，雙鏈的 DNA—RNA分子要比雙鏈的 DNA—DNA分子更為穩(wěn)定。因此，當(dāng) RNA探針及待測(cè) DNA的混合物置于這種退火條件下， RNA便會(huì)同它的購(gòu) DNA分子中的互補(bǔ)序列退火形成穩(wěn)定的 DNA—RNA雜交分子，而使被取代的 DNA鏈處于單鏈狀態(tài)。這種由單鏈 DNA分支和雙鏈 DNARNA分支形成的“泡狀”體，叫做 R環(huán)結(jié)構(gòu)。 四、目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測(cè) ? 用 RNA印跡 (Northern blotting)法檢測(cè)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄的 RNA在一定條件下可以同轉(zhuǎn)錄該種 RNA的模板 DNA鏈進(jìn)行雜交的特性，制備目的基因 DNA探針，變性后同克隆子總RNA雜交，若出現(xiàn)明顯的雜交信號(hào)，可以認(rèn)定進(jìn)入受體細(xì)胞的目的基因轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的 mRNA。 五、目的基因翻譯產(chǎn)物檢測(cè) ? 最常用的是蛋白質(zhì)印跡 (Westernblotting)法。提取克隆子總蛋白質(zhì)，經(jīng) SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳按分子大小分開(kāi)后，轉(zhuǎn)移到供雜交用的膜上，隨后與放射性同位素或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，通過(guò)一系列抗原抗體反應(yīng)，在雜交膜上顯示出明顯的雜交信號(hào)，表明受體細(xì)胞中存在目的基因表達(dá)產(chǎn)物。 一、基礎(chǔ)理論研究： ?基因的結(jié)構(gòu)與功能。 ?基因的人工定點(diǎn)突變。 ?人類基因組計(jì)劃 ? 基因工程是一項(xiàng)非常復(fù)雜的技術(shù)操作，它的環(huán)節(jié)之繁多、操作之細(xì)致是其他工程所無(wú)法比擬的。但是如果拋開(kāi)細(xì)節(jié)問(wèn)題，基因工程操作流程還是比較明了的。它的基本步驟可以大致歸納如下： 小結(jié) ? （ 1）獲取目的基因，即用各種不同的方法取得人所需要的基因，也就是某些 DNA片段。那里面含有一種或幾種遺傳信息的全套遺傳密碼。獲取目的基因是基因工程操作的關(guān)鍵。 ? （ 2）獲取基因載體。用人工方法，取得目的基因的適宜的載體，即質(zhì)?；虿《尽］d體一般帶有必要的標(biāo)志基因，以便進(jìn)行檢測(cè)。 ? (3)重組 DNA，即用人工方法，讓目的基因與運(yùn)載體相結(jié)合，首先要用限制性內(nèi)切酶和其他一些酶類，切割或修飾載體 DNA和目的基因，然后用連接酶將兩者連接起來(lái)，使目的基因插入載體內(nèi)，形成重組 DNA分子。這些工作都在生物體