【正文】 s)， Km=2 105mol/L，現(xiàn)將固定化酶顆粒裝入底物濃度為 1 105mol/L的反應(yīng)器中，并已知在這一操作條件下的流體傳質(zhì)系數(shù)為 4 101(1/S)，求：底物在固定化酶的外表面的反應(yīng)速率。 2. 圖解 最大傳質(zhì)速率最大反應(yīng)速率??D[ S ]m a xakrDL?? 2. 圖解 ? 底物在固定化酶外表面處的濃度應(yīng)同時滿足傳質(zhì)速率方程式和反應(yīng)速率方程式，因此可通過作圖法求出 [S]值和相應(yīng)的速率值。 ? 應(yīng)用： ，即 Da ＜＜ 1 ① 降低固定化酶顆粒的粒徑，增大比表面積，但由于粒徑減小會伴隨壓降增加，因此應(yīng)用中綜合考慮，確定合適的粒徑。接近本征動力學(xué)； Da ＞＞ 1時，則底物最大擴散速率要大大慢于酶催化底物的反應(yīng)速率，此時該反應(yīng)過程為傳質(zhì)擴散控控制。 RS=NS， C*=[S] S/[S], K=Km/[S] 1 C*= Da C*/（ K + C* ） α ＜ 0 α ＞ 0 + α = Da +K1， [S] S= C* [S] SmSm a xS]S[K]S[rR??NS=kLα（ [S][S]S） [ S ]m a xakrDL?????????????? 1412 2**?? KC Dα—— 重要無因次數(shù)群 ? 定義 ： ? 物理意義可表示為 ： 1. 當 Da ＜＜ 1時，酶催化最大反應(yīng)速率要大大慢于底物的擴散速率。 ? 假定對一非帶電的固定化酶 ， 其外表面上的反應(yīng)速率符合 M— M方程形式 ， 即 底物由液相主體擴散到固定化酶外表面的速率應(yīng)表示為 NS=kLα([S][S]S) kLα—— 體積氧傳遞系數(shù) （ 1/S） ? 定態(tài)條件下 ， 應(yīng)存在 Rs＝ Ns， 即該式表示了在定態(tài)條件下 ， 外擴散傳質(zhì)速率等于在固定化酶外表面上底物的反應(yīng)速率 。 ? 所建立的宏觀動力學(xué)方程也不完全服從M— M方程形式 。 ? 固有動力學(xué) 在本征動力學(xué)的基礎(chǔ)上，僅僅考慮由于這種分配效應(yīng)而造成的濃度差異對動力學(xué)產(chǎn)生的影響，所建立的動力學(xué)稱為固有動力學(xué) ? 表觀動力學(xué) 表觀動力學(xué) ? 不論分配效應(yīng)是否存在，固定化酶受到擴散限制時所觀察到的速率稱為有效反應(yīng)速率，或稱為宏觀反應(yīng)速率。 對后者 ， 它僅將空間效應(yīng)的影響考慮在內(nèi) 。 ? 特點：可以通過引入相應(yīng)的參數(shù)進行定量分析。這種擴散過程的速率在某些情況下可能會對反應(yīng)速率產(chǎn)生限制作用。 （ 5）擴散限制 ? 指底物、產(chǎn)物及其他效應(yīng)物的遷移和傳遞速度所受到的一種限制。 ? 特點：可以通過分配速率 KP來定量描述 （ 4）分配效應(yīng) Kp的定義是載體內(nèi)外底物 (或其他物質(zhì) )濃度之比 。 ? 特點：這種效應(yīng)難以定量描述和預(yù)見 ， 但可以通過改變載體與介質(zhì)的性質(zhì)而做出判斷與調(diào)節(jié) 。 ? 特點： 選擇適宜的載體與固定化方法，可消除這種不利因素的影響，但這種效應(yīng)難以定量描述 與預(yù)測。 多出現(xiàn)于吸附法和共價偶聯(lián)法的固定化酶中 。 固定化酶反應(yīng)歷程 影響固定化酶動力學(xué)的因素 （ 1）分子構(gòu)象的改變 ：指固定化過程中酶和載體的相互作用引起酶的活性中心或調(diào)節(jié)中心的構(gòu)象發(fā)生了變化，導(dǎo)致酶與底物的結(jié)合活力下降的一種效應(yīng)。 ? ①和② 、⑥和⑦是屬于外擴散過程， ④、 ⑤則為內(nèi)擴 散過程。 上述兩種指標之差別在于是否考慮了所剩余的未被固定化的酶。 ? 酶活力表現(xiàn)率 （ 相對活力 ） ： 實際測定的固定化酶的總活力與被固定化了的酶在溶液狀態(tài)時的總活力之比 。也有少數(shù)酶固定化后活性無變化，甚至有所增大。 ? 原因： ① 酶自身的變化 —— 主要由于活性中心氨基酸殘基 、 空間結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)變化； ② 載體的物理和化學(xué)性質(zhì)的變化 。 ? 適合范圍 ：小 分子底物和產(chǎn)物的酶 ， 因為只有小分子才可以通過高分子凝膠的網(wǎng)格進行擴散 。 ? 微囊型：包埋在高分子半透膜中的方法 。 ? 特點： 應(yīng)用條件較激烈、酶活回收率低。 ? 此法與共價結(jié)合法一樣也是利用共價鍵固定酶的， 不同的是它不使用載體 。代表性的方法有重氮法 、 溴化氰法等 。 可與載體結(jié)合的酶的功能團有氨基 、 羧基 、 羥基 、 酚基等 。 ： ? C共價結(jié)合法 ： 酶以共價結(jié)合于載體的固定化方法 ， 它是載體結(jié)合法中應(yīng)用最多的一種 。 例如 DEAE— 纖維素 、 GM— 纖維素等 ? 特點 ：操作簡單 ， 條件溫和 ， 酶的高級結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞 ， 能得到酶活回收率較高的固定化酶 。 ： ? ：酶通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體的固定化方法 。載體有活性炭、多孔玻璃、氧化鋁、硅膠、淀粉、合成樹脂等。根據(jù)結(jié)合的形式不同，又可分為 物理吸附法、離子結(jié)合法和共價結(jié)合法 等。 ? 優(yōu)點 ： 不僅固定化酶可以反復(fù)使用 ， 而且產(chǎn)物不受污染容易精制；固定化后的酶大多數(shù)情況下其穩(wěn)定性增加 ， 僅有少數(shù)的穩(wěn)定性下降；固定化酶有一定的形狀和一定的機械強度 ， 可以裝填在反應(yīng)器中長期使用 ， 便于實現(xiàn)生產(chǎn)連續(xù)化和自動化 。 它是通過物理或化學(xué)的方法使溶液酶轉(zhuǎn)變?yōu)樵谝欢ǖ目臻g內(nèi)其運動受到完全約束 、 或受到局部約束的一種不溶于水 ， 但仍具活性的酶 。 對零級不可逆反應(yīng)， [S]值趨于無窮大，因此有 對該式積分 ， 得到 當 [s]足夠大時 ， 上式可簡化為 進行積分得到 t2dt ]S[d ek ???dteek]S[ t0 tt20 ???tdtddt ]E[d ekek ?????]t)ke x p [kee rd0t （???復(fù)習(xí)題： 1. 復(fù)雜酶催化動力學(xué)模型有哪幾類型？ 2. Michaelis假設(shè)怎樣描述 pH對酶催化反應(yīng)速率的影響？ ？ ，反應(yīng)機制為 E+S [ES] E+P E+P [EP] 試推導(dǎo)其反應(yīng)速率方程。 顯然其速率方程更加復(fù)雜 。 D． δ1時 ， 底物加速酶的失活 。 =0時 ， 酶完全被底物所保護 ， 復(fù)合物 [ES]完全不失活 ， 此時只有游離酶失活 。 ? 分析： A. 間隔取樣 B. 測定時間一致 C. 注意有無底物 D. 在最適 pH、溫度 酶的熱穩(wěn)定動力學(xué) ? 熱穩(wěn)定曲線：在一定條件下，使酶溶液不同的恒溫中保持一定時間，在酶的最適 pH、溫度條件下測定其活力，以殘存酶活力與失活處理溫度作圖，即得該活曲線。 ④ 速率控制步驟為由 EHS生成產(chǎn)物的速率 。 ② 上述三種解離狀態(tài)中 ， 只有 EH型具有催化活性 。 A. pH對酶穩(wěn)定性影響（臺形） B. pH對酶活性影響（鐘形） ? 產(chǎn)生的原因： pH改變酶的活性中心，即改變其解離狀態(tài)，從而反應(yīng)速率。 ? 最初底物具有一定的聚合度分布，底物種類很多；一般高分子底物的聚合度越大，酶促的反應(yīng)速率越大。 min ) 28 18 36 24 43 30 63 51 74 63 解 :由題意作 LB 圖 ,有圖可知 1/Km= 1/KmI= ， 1/rmax=1 102 rmax=100 Km= KmI= 102 KI= 復(fù)雜酶催化動力學(xué) A+B+C+ ??? P+Q+R+ ??? 隨機機制 順序機制 雙底物機制 有序機制 乒乓機制 TC機制 隨機機制 ① 順序機制 ② TC機制 ③ 乒乓機制 ? 多底物反應(yīng)可看成是一組反應(yīng)。 底物初始濃度 [S]0 mmol/L 無抑制時速率 rso mmol/(L 琥珀酸脫氫酶受丙二酸及草酰乙酸抑制。 ?作用機制： 抑制劑的主要作用是直接或間接地影響酶活性中心，改變活性中心的三維構(gòu)象，占據(jù)酶活性中心，從而使酶與底物的結(jié)合機率下降。試確定可否用米氏方程來描述反應(yīng)速率，若可以，求 Km和 k+2。 ? HW法 特點：橫坐標均勻，易作圖，誤差小，便于分析 ? EH法（誤差?。? 特點：易作圖，誤差小，但不易測量 ? 積分法 特點：誤差小，不經(jīng)變量計算，工程上常用 ]S[1rKr1m a xmm a xr1s ???m a xm a xmr]s[r]S[rKs??]S[rKrr smm a xs ??mm KSStKrSSSS1_][][][][][][ln0m a x00????例 2 有一均相酶催化反應(yīng)， Km值為 2 103mol/L,當?shù)孜锏某跏紳舛?[S]0為 1 105mol/L，若反應(yīng)進行 1min，則有2%的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。 E,[S],X和 [P]分別與下式對應(yīng)的濃度。 底物濃度遠遠高于酶的濃度。 ? 推倒： ? 動力學(xué)參數(shù)：同 M—— M ][][m ax,SKSrrrmpps ????0X ?dtdekr p 2m a x, ?? 121??? ??kkkKm③ 兩種方程（學(xué)說）比較 項目 M— M方程 B— H方程 假設(shè) 酶和底物生成不穩(wěn)定復(fù)合物 [ES]，酶催化反應(yīng)是經(jīng)中間復(fù)合物完成的。 推導(dǎo)： eo=e+X k+1e[S]=k1X rp= k+2X ][][m ax,SKSrrrSppp ????ekr p 2m a x, ??11???kkKs 動力學(xué)參數(shù)： ? KS為 rP=1/2rP,max時的底物濃度， 表示酶與底物相互作用的特性； ?rP,max表示當全部的酶分子都變成 [ES]的反應(yīng)速度； ? k+2表示單位時間內(nèi)一個酶分子所催化底物發(fā)生反應(yīng)的分子 ， 即表示酶催化能力大小 —— 轉(zhuǎn)換系數(shù) 。 1913年 Michaelis和 Menten推導(dǎo)米氏方程 。 故可以忽略有于生成中間復(fù)合物 ES而消耗的底物； ? 產(chǎn)物的濃度是很低的 ， 因而產(chǎn)物的抑制作可以忽略 ， 同時也不考慮 P+E ES這個逆反應(yīng)的存在 。 酶反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ) 。 G0(初始葡萄糖濃度） =。此反應(yīng)為一級反應(yīng)，反應(yīng)如下 G L P 求中間產(chǎn)物（葡萄糖內(nèi)酯）濃度達到最大時所需要的時間 tmax及其最大濃度值 [L] max。反應(yīng)快， k數(shù)值大。 k與溫度、催化劑有關(guān)。 Ks是溫度的函數(shù) 。 drcrbrar DCBA ???badc]B[]A[]D[]C[K ?③ 解離常數(shù) Ks： aA+bB cC+dD Ks =1/K ? 意義： 衡量解離進行程度大小的一個常數(shù) 。表示反應(yīng)進行程度越大，即反應(yīng)進行的越完全；反之， K越，表示反應(yīng)進行程度越小，即反應(yīng)進行的越不完全。 計算法：例 1 tcddy = dc/dt = 5 a5 t4 + 4 a4 t3 + 3 a3 t2 + 2 a2 t + a1 aA+bB cC+dD ② 平衡常數(shù) K ? 意義：衡量反應(yīng)進行程度大小的一個常數(shù)。微分上式得 然后代入任一時刻的 t值，得 y值。 tcdd 例如某一反應(yīng) : aA bB 濃度 時間 點處斜率）為 acdbccdbcadC A (1dta1r ????