【正文】 ? 動(dòng)力學(xué)參數(shù)：同 M—— M ][][m ax,SKSrrrmpps ????0X ?dtdekr p 2m a x, ?? 121??? ??kkkKm③ 兩種方程（學(xué)說）比較 項(xiàng)目 M— M方程 B— H方程 假設(shè) 酶和底物生成不穩(wěn)定復(fù)合物 [ES]，酶催化反應(yīng)是經(jīng)中間復(fù)合物完成的。 E,[S],X和 [P]分別與下式對(duì)應(yīng)的濃度。試確定可否用米氏方程來描述反應(yīng)速率，若可以，求 Km和 k+2。 琥珀酸脫氫酶受丙二酸及草酰乙酸抑制。 min ) 28 18 36 24 43 30 63 51 74 63 解 :由題意作 LB 圖 ,有圖可知 1/Km= 1/KmI= ， 1/rmax=1 102 rmax=100 Km= KmI= 102 KI= 復(fù)雜酶催化動(dòng)力學(xué) A+B+C+ ??? P+Q+R+ ??? 隨機(jī)機(jī)制 順序機(jī)制 雙底物機(jī)制 有序機(jī)制 乒乓機(jī)制 TC機(jī)制 隨機(jī)機(jī)制 ① 順序機(jī)制 ② TC機(jī)制 ③ 乒乓機(jī)制 ? 多底物反應(yīng)可看成是一組反應(yīng)。 A. pH對(duì)酶穩(wěn)定性影響（臺(tái)形） B. pH對(duì)酶活性影響（鐘形） ? 產(chǎn)生的原因： pH改變酶的活性中心，即改變其解離狀態(tài)，從而反應(yīng)速率。 ④ 速率控制步驟為由 EHS生成產(chǎn)物的速率 。 =0時(shí) ， 酶完全被底物所保護(hù) ， 復(fù)合物 [ES]完全不失活 ， 此時(shí)只有游離酶失活 。 顯然其速率方程更加復(fù)雜 。 它是通過物理或化學(xué)的方法使溶液酶轉(zhuǎn)變?yōu)樵谝欢ǖ目臻g內(nèi)其運(yùn)動(dòng)受到完全約束 、 或受到局部約束的一種不溶于水 ， 但仍具活性的酶 。根據(jù)結(jié)合的形式不同，又可分為 物理吸附法、離子結(jié)合法和共價(jià)結(jié)合法 等。 ： ? ：酶通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體的固定化方法 。 ： ? C共價(jià)結(jié)合法 ： 酶以共價(jià)結(jié)合于載體的固定化方法 ， 它是載體結(jié)合法中應(yīng)用最多的一種 。代表性的方法有重氮法 、 溴化氰法等 。 ? 特點(diǎn)： 應(yīng)用條件較激烈、酶活回收率低。 ? 適合范圍 ：小 分子底物和產(chǎn)物的酶 ， 因?yàn)橹挥行》肿硬趴梢酝ㄟ^高分子凝膠的網(wǎng)格進(jìn)行擴(kuò)散 。也有少數(shù)酶固定化后活性無變化，甚至有所增大。 上述兩種指標(biāo)之差別在于是否考慮了所剩余的未被固定化的酶。 固定化酶反應(yīng)歷程 影響固定化酶動(dòng)力學(xué)的因素 （ 1）分子構(gòu)象的改變 ：指固定化過程中酶和載體的相互作用引起酶的活性中心或調(diào)節(jié)中心的構(gòu)象發(fā)生了變化，導(dǎo)致酶與底物的結(jié)合活力下降的一種效應(yīng)。 ? 特點(diǎn)： 選擇適宜的載體與固定化方法，可消除這種不利因素的影響，但這種效應(yīng)難以定量描述 與預(yù)測(cè)。 ? 特點(diǎn)：可以通過分配速率 KP來定量描述 （ 4）分配效應(yīng) Kp的定義是載體內(nèi)外底物 (或其他物質(zhì) )濃度之比 。這種擴(kuò)散過程的速率在某些情況下可能會(huì)對(duì)反應(yīng)速率產(chǎn)生限制作用。 對(duì)后者 ， 它僅將空間效應(yīng)的影響考慮在內(nèi) 。 ? 所建立的宏觀動(dòng)力學(xué)方程也不完全服從M— M方程形式 。 RS=NS， C*=[S] S/[S], K=Km/[S] 1 C*= Da C*/（ K + C* ） α ＜ 0 α ＞ 0 + α = Da +K1， [S] S= C* [S] SmSm a xS]S[K]S[rR??NS=kLα（ [S][S]S） [ S ]m a xakrDL?????????????? 1412 2**?? KC Dα—— 重要無因次數(shù)群 ? 定義 ： ? 物理意義可表示為 ： 1. 當(dāng) Da ＜＜ 1時(shí)，酶催化最大反應(yīng)速率要大大慢于底物的擴(kuò)散速率。 ? 應(yīng)用： ，即 Da ＜＜ 1 ① 降低固定化酶顆粒的粒徑，增大比表面積，但由于粒徑減小會(huì)伴隨壓降增加，因此應(yīng)用中綜合考慮，確定合適的粒徑。 s)， Km=2 105mol/L，現(xiàn)將固定化酶顆粒裝入底物濃度為 1 105mol/L的反應(yīng)器中，并已知在這一操作條件下的流體傳質(zhì)系數(shù)為 4 101(1/S)，求：底物在固定化酶的外表面的反應(yīng)速率。 2. 圖解 最大傳質(zhì)速率最大反應(yīng)速率??D[ S ]m a xakrDL?? 2. 圖解 ? 底物在固定化酶外表面處的濃度應(yīng)同時(shí)滿足傳質(zhì)速率方程式和反應(yīng)速率方程式，因此可通過作圖法求出 [S]值和相應(yīng)的速率值。接近本征動(dòng)力學(xué)； Da ＞＞ 1時(shí)，則底物最大擴(kuò)散速率要大大慢于酶催化底物的反應(yīng)速率，此時(shí)該反應(yīng)過程為傳質(zhì)擴(kuò)散控控制。 ? 假定對(duì)一非帶電的固定化酶 ， 其外表面上的反應(yīng)速率符合 M— M方程形式 ， 即 底物由液相主體擴(kuò)散到固定化酶外表面的速率應(yīng)表示為 NS=kLα([S][S]S) kLα—— 體積氧傳遞系數(shù) （ 1/S） ? 定態(tài)條件下 ， 應(yīng)存在 Rs＝ Ns， 即該式表示了在定態(tài)條件下 ， 外擴(kuò)散傳質(zhì)速率等于在固定化酶外表面上底物的反應(yīng)速率 。 ? 固有動(dòng)力學(xué) 在本征動(dòng)力學(xué)的基礎(chǔ)上，僅僅考慮由于這種分配效應(yīng)而造成的濃度差異對(duì)動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生的影響，所建立的動(dòng)力學(xué)稱為固有動(dòng)力學(xué) ? 表觀動(dòng)力學(xué) 表觀動(dòng)力學(xué) ? 不論分配效應(yīng)是否存在，固定化酶受到擴(kuò)散限制時(shí)所觀察到的速率稱為有效反應(yīng)速率，或稱為宏觀反應(yīng)速率。 ? 特點(diǎn)：可以通過引入相應(yīng)的參數(shù)進(jìn)行定量分析。 （ 5）擴(kuò)散限制 ? 指底物、產(chǎn)物及其他效應(yīng)物的遷移和傳遞速度所受到的一種限制。 ? 特點(diǎn)：這種效應(yīng)難以定量描述和預(yù)見 ， 但可以通過改變載體與介質(zhì)的性質(zhì)而做出判斷與調(diào)節(jié) 。 多出現(xiàn)于吸附法和共價(jià)偶聯(lián)法的固定化酶中 。 ? ①和② 、⑥和⑦是屬于外擴(kuò)散過程， ④、 ⑤則為內(nèi)擴(kuò) 散過程。 ? 酶活力表現(xiàn)率 （ 相對(duì)活力 ） ： 實(shí)際測(cè)定的固定化酶的總活力與被固定化了的酶在溶液狀態(tài)時(shí)的總活力之比 。 ? 原因： ① 酶自身的變化 —— 主要由于活性中心氨基酸殘基 、 空間結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)變化； ② 載體的物理和化學(xué)性質(zhì)的變化 。 ? 微囊型：包埋在高分子半透膜中的方法 。 ? 此法與共價(jià)結(jié)合法一樣也是利用共價(jià)鍵固定酶的， 不同的是它不使用載體 。 可與載體結(jié)合的酶的功能團(tuán)有氨基 、 羧基 、 羥基 、 酚基等 。 例如 DEAE— 纖維素 、 GM— 纖維素等 ? 特點(diǎn) ：操作簡(jiǎn)單 ， 條件溫和 ， 酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞 ， 能得到酶活回收率較高的固定化酶 。載體有活性炭、多孔玻璃、氧化鋁、硅膠、淀粉、合成樹脂等。 ? 優(yōu)點(diǎn) ： 不僅固定化酶可以反復(fù)使用 ， 而且產(chǎn)物不受污染容易精制；固定化后的酶大多數(shù)情況下其穩(wěn)定性增加 ， 僅有少數(shù)的穩(wěn)定性下降；固定化酶有一定的形狀和一定的機(jī)械強(qiáng)度 ， 可以裝填在反應(yīng)器中長(zhǎng)期使用 ， 便于實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)連續(xù)化和自動(dòng)化 。 對(duì)零級(jí)不可逆反應(yīng)， [S]值趨于無窮大，因此有 對(duì)該式積分 ， 得到 當(dāng) [s]足夠大時(shí) ， 上式可簡(jiǎn)化為 進(jìn)行積分得到 t2dt ]S[d ek ???dteek]S[ t0 tt20 ???tdtddt ]E[d ekek ?????]t)ke x p [kee rd0t （???復(fù)習(xí)題： 1. 復(fù)雜酶催化動(dòng)力學(xué)模型有哪幾類型？ 2. Michaelis假設(shè)怎樣描述 pH對(duì)酶催化反應(yīng)速率的影響？ ？ ，反應(yīng)機(jī)制為 E+S [ES] E+P E+P [EP] 試推導(dǎo)其反應(yīng)速率方程。 D． δ1時(shí) ， 底物加速酶的失活 。 ? 分析： A. 間隔取樣 B. 測(cè)定時(shí)間一致 C. 注意有無底物 D. 在最適 pH、溫度 酶的熱穩(wěn)定動(dòng)力學(xué) ? 熱穩(wěn)定曲線：在一定條件下，使酶溶液不同的恒溫中保持一定時(shí)間，在酶的最適 pH、溫度條件下測(cè)定其活力，以殘存酶活力與失活處理溫度作圖，即得該活曲線。 ② 上述三種解離狀態(tài)中 ， 只有 EH型具有催化活性 。 ? 最初底物具有一定的聚合度分布，底物種類很多；一般高分子底物的聚合度越大，酶促的反應(yīng)速率越大。 底物初始濃度 [S]0 mmol/L 無抑制時(shí)速率 rso mmol/(L ?作用機(jī)制： 抑制劑的主要作用是直接或間接地影響酶活性中心，改變活性中心的三維構(gòu)象，占據(jù)酶活性中心，從而使酶與底物的結(jié)合機(jī)率下降。 ? HW法 特點(diǎn)：橫坐標(biāo)均勻，易作圖，誤差小，便于分析 ? EH法（誤差?。? 特點(diǎn)：易作圖，誤差小，但不易測(cè)量 ? 積分法 特點(diǎn)：誤差小，不經(jīng)變量計(jì)算，工程上常用 ]S[1rKr1m a xmm a xr1s ???m a xm a xmr]s[r]S[rKs??]S[rKrr smm a xs ??mm KSStKrSSSS1_][][][][][][ln0m a x00????例 2 有一均相酶催化反應(yīng)， Km值為 2 103mol/L,當(dāng)?shù)孜锏某跏紳舛?[S]0為 1 105mol/L，若反應(yīng)進(jìn)行 1min，則有2%的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。 底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酶的濃度。 推導(dǎo)： eo=e+X k+1e[S]=k1X rp= k+2X ][][m ax,SKSrrrSppp ????ekr p 2m a x, ??11???kkKs 動(dòng)力學(xué)參數(shù)： ? KS為 rP=1/2rP,max時(shí)的底物濃度， 表示酶與底物相互作用的特性； ?rP,max表示當(dāng)全部的酶分子都變成 [ES]的反應(yīng)速度； ? k+2表示單位時(shí)間內(nèi)一個(gè)酶分子所催化底物發(fā)生反應(yīng)的分子 ， 即表示酶催化能力大小 —— 轉(zhuǎn)換系數(shù) 。 故可以忽略有于生成中間復(fù)合物 ES而消耗的底物； ? 產(chǎn)物的濃度是很低的 ， 因而產(chǎn)物的抑制作可以忽略 ， 同時(shí)也不考慮 P+E ES這個(gè)逆反應(yīng)的存在 。 G0(初始葡萄糖濃度） =。反應(yīng)快， k數(shù)值大。 Ks是溫度的函數(shù) 。表示反應(yīng)進(jìn)行程度越大，即反應(yīng)進(jìn)行的越完全；反之， K越，表示反應(yīng)進(jìn)行程度越小，即反應(yīng)進(jìn)行的越不完全。微分上式得 然后代入任一時(shí)刻的 t值，得 y值。例如反應(yīng) ? 2AB(g) = H2(g)+ I2(g) r瞬時(shí)速率一般有兩種方法 ? 作圖法 通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定出不同時(shí)間某一物質(zhì)的濃度，然后作出 Ct曲線，再從 Ct曲線圖上于某時(shí)刻 t處作切線，并求出切線的斜率（ ），從而獲得瞬時(shí)速率 r 。L1L1 U/mg 或 kat /mg ? 生物催化劑 ， 具有一般催化劑所特有的特性 —— 不能改變反應(yīng)的平衡點(diǎn) ， 只能改變反應(yīng)速率 ， 反應(yīng)條件溫和 。 本章的難點(diǎn)： ① 米氏方程及抑制劑動(dòng)力學(xué)等有關(guān)的推導(dǎo)； ② 酶失活動(dòng)力學(xué)的意義及推導(dǎo) 。 不能替代實(shí)驗(yàn)研究 。 英國(guó)學(xué)者阿特金遜 （ 1971） 首次提出生化反應(yīng)工程 …… 。 龍山文化泛指中國(guó)黃河中、下游地區(qū)約當(dāng)新石器時(shí)代晚期的一類文化遺存。 ,使生化工程誕生 . 特點(diǎn)是好氣發(fā)酵 ,產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜 ,次級(jí)代謝物 , 培養(yǎng)液含量低 ,無菌條件高 . 深層培養(yǎng)技術(shù) 、 無菌空氣制備技術(shù) —— 分批 、 連續(xù)與流加操作 e. 20世紀(jì) 50年代 , 氨基酸工業(yè) , 60年代 : 酶制劑 . 60年代固定化技術(shù) —— 新概念 —— 生物反應(yīng)器 .70年代基因工程 —— 特殊生