【正文】 或葡萄糖是常規(guī)的碳源，而果糖的利用效果較差。通常增加培養(yǎng)基中蔗糖的含量，可增加培養(yǎng)細(xì)胞的次生代謝產(chǎn)物量。前兩種不穩(wěn)定，能被細(xì)胞釋放的酶降解，而后兩種被細(xì)胞降解的較慢，對(duì)熱穩(wěn)定。 4．維生素 在各種維生素中，硫胺素（維生素 B2）可能是必需的，而煙酸和吡哆辛（維生素 B6）對(duì)生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。 6．有機(jī)酸 在以銨鹽作為單一氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，加人丙酮酸或者三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物如檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸等，能夠保證植物細(xì)胞生長(zhǎng)，并且耐受鉀鹽的能力也有所提高。對(duì)于吲哚乙酸、吲哚丁酸、 2， 4二氯苯氧基 乙酸和萘乙酸這樣難溶于水的生長(zhǎng)激素類物質(zhì)，配溶液時(shí)可先溶于 95%的酒精中，然后慢慢加人蒸餾水，稍微加熱，稀釋至所需體積，再調(diào)節(jié) pＨ。配制細(xì)胞分裂素物質(zhì)，應(yīng)先用少量濃度為 1mol/L的鹽酸來(lái)溶解，然后加蒸餾水至所需量。植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器最初大多采用微生物反應(yīng)器。 （一）機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器 機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器 混合程度高，適應(yīng)性廣，能獲得很高的溶氧系數(shù) KLa，在大規(guī)模生產(chǎn)中廣泛使用。 Kaman 等采用帶有 1 個(gè)雙螺旋帶狀葉輪(helicalribbonimpeller)和 3 個(gè)表面擋板的攪拌罐，證明適于剪切力敏感的高密度細(xì)胞培養(yǎng)。另有方框型槳式攪拌、蝶型渦輪攪拌等不同形式的機(jī)械攪拌罐用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)和研究，結(jié)果證明不同葉輪產(chǎn)生剪切力大小順序?yàn)闇u輪狀葉輪 平葉輪 螺旋狀葉輪。通過對(duì)培養(yǎng)紫蘇細(xì)胞 的生物反應(yīng)器比較發(fā)現(xiàn)鼓泡式反應(yīng)器優(yōu)于機(jī)械攪拌式反應(yīng)器。氣升式反應(yīng)器廣泛應(yīng)用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的研究和生產(chǎn)。將氣升式發(fā)酵罐與慢速攪拌結(jié)合使用可彌補(bǔ)低氣速時(shí)混合性差的弱點(diǎn)，采用分段的氣升管，也有利于氧的利用與混合。但大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)透光窗的設(shè)置，內(nèi)部培養(yǎng)物對(duì)光的均勻接受等問題難以解決，因此許多人對(duì)采用內(nèi)部光源的反應(yīng)器進(jìn)行了研究。每個(gè)單元中心固定一個(gè)玻璃管，光源插入其中，由攪拌槳實(shí)現(xiàn)混合，該攪拌漿設(shè)計(jì)成旋轉(zhuǎn)時(shí)不接觸玻璃管，玻璃管同時(shí)作為擋板，該反應(yīng)器在低轉(zhuǎn)速下仍有較高混合程度，而且剪切力較小。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)物用泵從反應(yīng)器中抽出，進(jìn)入柱中循環(huán)，所需的產(chǎn)物可分離得到，剩下的培養(yǎng)基回流到反應(yīng)器。細(xì)胞固定化是指將游離的細(xì)胞包埋在多糖或多聚化合物制備成的網(wǎng)狀支持物中、培養(yǎng)液呈流動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行無(wú)茵培養(yǎng)的一門技術(shù)。這些都使得固定化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)具有很大的發(fā)展?jié)摿Α㈦x心收集的植物細(xì)胞懸浮液與海藻第 15 頁(yè) 共 22 頁(yè) 酸鹽溶液混合，倒人塑料注射器中，然后慢慢滴人到含有 CaCl2的培養(yǎng)基中，不斷攪拌，形成球形顆粒。而 使用瓊脂糖固定植物細(xì)胞不需要其他離子來(lái)保證膠的穩(wěn)定性。 （ 3）兩相法 將細(xì)胞－ 固定劑 的懸浮溶液在不斷攪拌的情況下分散于豆油等有機(jī)相中，形成大小、形狀都比較均勻的液滴后置于冰浴中冷卻不斷攪拌，使其凝固，離心得到顆粒。 （六）植物細(xì)胞固定化反應(yīng)器 1．填充床反應(yīng)器 已被用于植物細(xì)胞的培養(yǎng)。 Nagai 等用固定床反應(yīng)器培養(yǎng)固定化煙草細(xì)胞，生長(zhǎng)速率與搖瓶相同，胞內(nèi)合成與搖瓶無(wú)明 顯區(qū)別。為了使基質(zhì)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物更完全，第 16 頁(yè) 共 22 頁(yè) 通常使之在反應(yīng)器中停留時(shí)間延長(zhǎng)。 Dubuis等用新型環(huán)回式 流化床反應(yīng)器 (loopfluidizedbedreactor)進(jìn)行 coffeaarabica 培養(yǎng)，測(cè)定了生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，認(rèn)為該反應(yīng)器操作方便，消除了氣體直接噴射引起的剪切力，易于測(cè)定放大所需的參數(shù)，適合中試和工業(yè)化生產(chǎn)。為加速傳質(zhì)通常采用 薄的步孔膜，然而，膜的厚度一定要足以在長(zhǎng)期操作中保持機(jī)械穩(wěn)定。對(duì)于給定 圖6 37 中 空纖維反應(yīng)器示意圖(中 間柱形部分為中空纖維管,表 面固定有細(xì)胞)營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)口營(yíng)養(yǎng)液出口 的膜型式及厚度，傳質(zhì)與膜表面積成正比。研究表明，除了膜以外，細(xì)胞層的厚度也很重要。 第 17 頁(yè) 共 22 頁(yè) 微藻培養(yǎng)生物反應(yīng)器 微藻 (microalgae)是指那些在顯微鏡下才能辨別其形態(tài)的微小藻類類群，它們是個(gè)體微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的單細(xì)胞植物，絕大多數(shù)營(yíng)光能自養(yǎng)生活，廣泛分布于淡、海水中。 80年代以來(lái)，微藻的培養(yǎng)和利用得到的迅猛的發(fā)展，已成為海洋開發(fā)中的新領(lǐng)域。 微藻能有效利用光能、 CO2 和無(wú)機(jī)鹽類合成蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物以及多種高附加值生物活性物質(zhì)，可以培養(yǎng)微藻來(lái)生產(chǎn)健康食品、食品添加劑、動(dòng)物飼料、生物肥料及其他天然產(chǎn)品。 一、微藻培養(yǎng)生物反應(yīng)器 與一般的動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)不同，微藻具有光合效率較高；可以在非常廣闊的區(qū)域范圍內(nèi)培養(yǎng)；應(yīng)用前景廣等特點(diǎn)。它包括天然大池和人工大池 兩種型式。最突出特點(diǎn)是技術(shù)簡(jiǎn)單、投資低廉及操作簡(jiǎn)便，在螺旋藻、小球藻和鹽藻的大規(guī)模培養(yǎng)中取得 了良好的效果。除了能采集光源外，其他很多方面與傳統(tǒng)微生物發(fā)酵用生物反應(yīng)器相似，它培養(yǎng)條件穩(wěn)定，可無(wú)菌操作，易進(jìn)行高密度培養(yǎng)，具有較大的面積體積比，受光面積大，光能利用率較高，已 成為今后的發(fā)展方第 18 頁(yè) 共 22 頁(yè) 向。含有微藻的培養(yǎng)液通過泵或空氣升液器的作用在管道中循環(huán)流動(dòng)。水平管式采用泵循環(huán)、氣升循環(huán)等方式混合，多數(shù)采用自然光，有的采用人工光源。劉晶瞞等利用自制的細(xì)管式光生物反應(yīng)器，對(duì)螺旋藻進(jìn)行高密度培養(yǎng)，并研究了螺旋藻液的流變特性和光強(qiáng)的影響及以及光暗比對(duì)反應(yīng)器體積產(chǎn)率與面積產(chǎn)率的影響，發(fā)現(xiàn)體積產(chǎn)率有光暗比飽和現(xiàn)象，而對(duì)于面積產(chǎn)率，存在 著最佳光暗比。以日光燈管作為內(nèi)外光源。張栩等在氣升式光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)裙帶菜配子體無(wú)性系。 李志勇等采用的反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示于圖 638，罐體直徑 182mm，高 1000mm，提升管直徑 131mm，高 600mm。反應(yīng)器并配置溶氧、 pH、溫度等在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，幾何參數(shù)如下 :高徑比 (H/D)，提升管截面積 Ar/下降截面積 ，氣體分布器直徑 50mm，氣體分布器孔徑 80μ m，照光面積與體積的比值 50m1。實(shí)驗(yàn)采用的可調(diào)恒定磁處理裝置如圖 639 所 示 (實(shí)際應(yīng)用中可用永磁鐵代替 )，磁極間距２ｃｍ；通過手柄調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度來(lái)改變磁場(chǎng)強(qiáng)度。由空氣過濾器通入純凈空氣，通氣量從轉(zhuǎn)子氣體流量計(jì)讀出。此外，還具有良好的混合與光能利用性能，并能實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)過程主要參數(shù)如ｐＨ、溶解氧、溫度等的自動(dòng)在線檢測(cè)與控制。這種新型的生物反應(yīng)器 —— 螺旋管式光生物反應(yīng)器最初作為鼓泡式反應(yīng)器使用，但接下來(lái)就作為氣升式反應(yīng)器使用。為防止起泡，可加入一些消泡劑。 脫氣裝置氣升裝置熱交換裝置空氣C02反應(yīng)器圖640 氣升式螺旋管式光生物反應(yīng)器 1986 年 Ramasde 等人首次開發(fā)平板式光生物反應(yīng)器。 第 21 頁(yè) 共 22 頁(yè) 空氣管冷卻水管噴水頭圖6 41 10 cm光 徑平板式光生物反應(yīng)器 徐明芳等采用自行設(shè)計(jì)的光輻射板式光生物反應(yīng)器，用有機(jī)玻璃板卷封粘接成長(zhǎng)方形結(jié)構(gòu)，用厚度為 30ｃｍ光電輻射板（內(nèi)設(shè)發(fā)光二極管， LED）交叉固定于反應(yīng)器內(nèi)側(cè)，作為內(nèi)部光源發(fā)射中心，使均勻發(fā)射的光能 極大透過發(fā)光表面直接照射在淺層藻液上，實(shí)現(xiàn)了螺旋藻單藻種群的優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)。同時(shí)，使用中空纖維筒作為氣體交換裝置， CO2 和 O2 的交 換率更高。反應(yīng)器外形為扁平箱式，內(nèi)部設(shè)有一層層交叉分布的隔板，隔板一端設(shè)有擋板，使藻液在隔板上形成一層淺液層，并靠溢流作用逐層向下流動(dòng)。 2342d Hh 0D　　圖644 8L溢濾噴射光生物反射器流程示意圖1溢濾噴射器；其中 D=60mm,d=20mm,H=990mm,h 0 =160mm。并且已成功從 8 升放大到 100 升。 1994年， Lee 采用發(fā)光二級(jí)管作為光源的生物反應(yīng)器，大大提高了光源的效率。同時(shí)由于作為光源的氙燈在反應(yīng)器內(nèi)部，因而反應(yīng)器不受內(nèi)部氙燈散熱的影響。由于該類型的反應(yīng)器具有結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)潔，可以隨意調(diào)節(jié)放置角度以便使其獲得最佳的取光效果，容易加工制造，可以根據(jù)需要設(shè)計(jì)不同的光徑以及操作條件容易控制等優(yōu)點(diǎn)，使其成為具有良好使用價(jià)值的光生物反應(yīng)器。反應(yīng)器主要由光源、循環(huán)裝置、板式反應(yīng)器、控溫系統(tǒng)、培養(yǎng)介質(zhì)與 CO2 供給系統(tǒng)組成。使用前，反應(yīng)器、熱交換裝置、脫氣裝置以及另外的一些管道系統(tǒng)最初用自來(lái)水清洗，然后用 %的次氯酸鈉循環(huán)洗滌，最后用蒸餾水洗去有機(jī)物及一些無(wú)機(jī)殘余物。 （ 3）氣升式螺旋管式光生物反應(yīng)器 2020 年， L． Tavieso 等用螺旋管式光生物反應(yīng)器來(lái)培養(yǎng)螺旋藻，當(dāng)稀釋率為 1∶ 5 時(shí)，最大產(chǎn)量可達(dá)到 ?d。實(shí)際運(yùn)行結(jié)果表明，當(dāng)工作體積為 12Ｌ時(shí)分批培養(yǎng)螺旋藻，最大細(xì)胞干重可達(dá) /Ｌ。在控制儀表上設(shè)定控制溫度和 pＨ值，利用循環(huán)水熱交換器由電磁閥自動(dòng)控制溫度； pＨ由二氧化碳通過電磁閥自動(dòng)調(diào)節(jié)。管道氣升式循環(huán)磁處理光生物反應(yīng)器主要由光生物 圖6 39 氣 升式循環(huán)磁處理光生物反應(yīng)器23456 7891011 1 變壓器 2 調(diào) 整器 3 電表 4 伏特計(jì) 5 電線 6 磁強(qiáng)記錄儀 7 卷 8 探針 9 鐵制蒸餾器 10 外殼 11 支架 反應(yīng)器主體和相應(yīng)的供氣、光源、磁處理、熱交換、加料、收獲以及檢測(cè)和控制系統(tǒng)組成。總體積為 15L，工作體積 13L。王長(zhǎng)海等用氣升內(nèi)環(huán)流光生物反應(yīng)器對(duì)紫球藻進(jìn)行培養(yǎng)，透明的反應(yīng)器外部以 12 支 40Ｗ熒光燈為光照系統(tǒng)，利用 CＯ 2 為碳源，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和生物量產(chǎn)率分別達(dá)到了 1 和 42031ｇ /ｍ 2。該系統(tǒng)的核心在于將 160m 長(zhǎng)的 Polycarbonate 管分成 8 只，以集合管相連。 （ 1）氣升式光生物反應(yīng)器 氣升式光生物反應(yīng)器一般由罐體、氣體提升管、內(nèi)光源密封管、熱交換裝置、氣體分布器、內(nèi)外光源等部分組成。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)傾斜角度為 80176。 Print SJ 等設(shè)計(jì)制作的光生物反應(yīng)器，可以被認(rèn)為是微藻光生物反應(yīng)器發(fā)展史上的里程碑。 1．管式光反應(yīng)器（ Tubular photobioreactor） 管式光反應(yīng)器是目前應(yīng)用最為普遍的光生物反應(yīng)器之一。雖有許多嘗試改進(jìn)該系統(tǒng)，但對(duì)于大部分有開發(fā)價(jià)值的微藻，特別是基因工程微藻，開放式培養(yǎng)并不適宜。 人工開放式培養(yǎng)一般用水泥池，再附加攪拌、二氧化碳控制等裝置。目前，微藻培養(yǎng)主要有開放式大池培養(yǎng)和密閉式生物反應(yīng)器培養(yǎng)兩種方式。另外，開發(fā)微藻資源對(duì)于減緩?fù)恋?、環(huán)境、能源和人口危機(jī)，研制和生產(chǎn)出新型生物醫(yī)學(xué)產(chǎn) 品及功能性食品，彌補(bǔ)傳統(tǒng)作物的不足與局限以及促進(jìn)傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)向工業(yè)化生產(chǎn)過渡都具有重要意義?？茖W(xué)家預(yù)計(jì)，到 2020 年，藻類將為世界提供 10%的蛋白質(zhì)。 自 20 世紀(jì) 50 年代以來(lái)，微藻應(yīng)用和培養(yǎng)的研究得到了穩(wěn)定的發(fā)展。 Lang 也研究了植物細(xì)胞膜反應(yīng)器，將細(xì)胞固定在膜上 3mm 厚一層，培養(yǎng)基在膜下封閉回路循環(huán)流動(dòng)，營(yíng)養(yǎng)透過膜擴(kuò)散至細(xì)胞層，次級(jí)代謝物分泌透過膜擴(kuò)散至培養(yǎng)基。最常用的膜反應(yīng)器是中空纖維和螺線式卷繞反應(yīng)器（如圖６－ 37 所示）。一旦選定膜，接下來(lái)便是確定反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)。由于膜的理化特性會(huì)嚴(yán)重影響膜反應(yīng)器的操作，因此，膜的選擇十分重要。同時(shí)保持低流速，或者使液體迅速通過流化床進(jìn)行循環(huán)，這都會(huì)導(dǎo)致液體的高度混合。通常采用小固定化顆粒。填充床反應(yīng)器每單位體積能容納大量細(xì)胞。 （ 4）大規(guī)模固定化法 步驟與滴入法基本相同，不同的是采用專門的固定化裝置進(jìn)行植物細(xì)胞的固定化。這種方法 制備的顆粒為柱形顆粒，可用于間歇式培養(yǎng)，不適合填充床式反應(yīng)器。與海藻酸鹽固定化不同的是卡拉膠必須加熱保持液態(tài)。經(jīng)常采用的固定劑主要是一些多糖和多聚化合物等，如海藻酸鹽、卡拉膠、瓊脂、瓊脂糖、角叉藻聚糖、明膠、聚丙酰胺等。固定化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是一項(xiàng)新型的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)植物細(xì)胞的固定化并不影響其代謝活動(dòng)，適合于細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)活性代謝產(chǎn)物。用 ACBR培養(yǎng)植物細(xì)胞，可以解除降解的影響，去除了引起產(chǎn)物抑制途徑的蛋白。 Yamamurak 等研究固定 CO2 的光反應(yīng)器，特別之處在于攪拌器具有發(fā)光作用。 Ogbonna 等研制了一種用于大規(guī)模培養(yǎng)光合細(xì)胞的新型內(nèi)部光照攪拌式光生物反 應(yīng)器，它由每個(gè)單元都包含光源的多個(gè)單元組成。 第 13 頁(yè) 共 22 頁(yè) 營(yíng)養(yǎng)液收獲回流加熱器氧氣氣體交換泵反應(yīng)塔DO傳感器圖634 非攪拌式生物反應(yīng)器 （三）光生物反應(yīng)器 許多植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中需要光照，往往考慮在普通反應(yīng) 器基礎(chǔ)上增加光照系統(tǒng)，但在實(shí)際中存在很多問題，如光源的安裝、保護(hù)，光的傳遞，還有光照系統(tǒng)對(duì)反應(yīng)器供氣、混合的影響等。氣升式反應(yīng)器用于多種植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)或固定化細(xì)胞培養(yǎng)，但其操作彈性較小，低氣速時(shí)，尤其 H/D 大，高密度培養(yǎng)時(shí)，混合性能欠佳。研究表明，噴大氣泡時(shí)，湍流剪切力是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和損害細(xì)胞的重要原因。 （二）非攪拌式生物反應(yīng)器 相對(duì)于傳統(tǒng)攪拌式反應(yīng)器，非攪拌式反應(yīng)器所產(chǎn)生的剪切力較小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，因此被認(rèn)為適合植物細(xì)胞培