[自然科學(xué)]第九章蛋白質(zhì)的測(cè)定(參考版)
2025-03-25 08:53本頁面
【正文】 。 2. 雙縮脲法測(cè)定原理。 ? 主要用途： 食品、農(nóng)產(chǎn)品樣品中氨基酸分析。 ? 儀器功能、附件： 氨基酸分析專用儀。 ③ 同時(shí)取 80mL水，先用 ，再加入，用 ，做試劑空白試驗(yàn)。 ② 加入 ，混勻。 m—— 測(cè)定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量， g —— 氮的毫摩爾質(zhì)量， g/m mol (3) 結(jié)果計(jì)算 1 0 00 1 )( 12?????mcVV 氨基酸態(tài)氮 （ %） (1) 原理 根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計(jì)的玻璃電極及甘汞電極同時(shí)插入被測(cè)液中構(gòu)成電池，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，依據(jù)酸度計(jì)指示的 pH值判斷和控制滴定終點(diǎn)。 V1—— 用中性紅作指示劑滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積， mL。分別紀(jì)錄兩次所消耗的堿液 ml數(shù)。這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來滴定 COOH基，并用間接的方法測(cè)定氨基酸的總量。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。 ? 本法在 0～ 100mg/L 蛋白質(zhì)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。此法簡(jiǎn)單而快速，適合大量樣品的測(cè)定，靈敏度與福林酚法相似，但不受酚類、游離氨基酸和小分子的影響。 ? 本法在 0～ 60mg/L 蛋白質(zhì)范圍呈良好線性關(guān)系。 酚比色法 原理 ? 蛋白質(zhì) (或多肽 )分子中含有酪氨酸或色氨酸 ,能與Folin酚試劑起氧化還原反應(yīng) ,生成藍(lán)色化合物 ,藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比 ,可用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 . 是檢測(cè)可溶性蛋白質(zhì)含量最靈敏的經(jīng)典方法之一。 ? ⑤ 當(dāng)肽鏈中含有脯氨酸時(shí)，若有多量糖類共存，則顯色不好，會(huì)使測(cè)定值偏低。 ? ③含脂肪高的樣品應(yīng)預(yù)先用醚抽出棄去。 （ 5）說明及注意事項(xiàng) ? ① 蛋白質(zhì)的種類不同，對(duì)發(fā)色程度影響不大。用測(cè)得的 A 值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得蛋白質(zhì)毫克數(shù)，進(jìn)而由此求得樣品中的蛋白質(zhì)含量。 （ 3）操作方法 ①標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 按蛋白質(zhì)含量 40mg、 50mg、 60mg、70mg、 80mg、 90mg、 100mg、 110mg 分別稱取混合均勻的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 8 支 50mL 納氏比色管中 各加入 1mL 四氯化碳 用堿性硫酸銅溶液準(zhǔn)確稀釋至 50mL 振搖 10min 靜置 1h 取上層清液離心5min 取離心分離后的透明液于比色皿中 以蒸餾水作參比液調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)并測(cè)定各溶液的吸光度 A 560nm 波長(zhǎng) ?蛋白質(zhì)的含量為橫坐標(biāo)，吸光度 A 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 C? 雙縮脲與堿及少量硫酸銅溶液作用生成紫紅色的配合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)： （ 2）方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍 ? 由于蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵（ CONH），與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，故也能呈現(xiàn)此反應(yīng)而生成紫紅色配合物，在一定條件下其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，據(jù)此可用吸收光度法來測(cè)定蛋白質(zhì)含量，該配合物的最大吸收波長(zhǎng)為 560nm ? 本法靈敏度較低，但操作簡(jiǎn)單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法。 KjeltecTM 8420 自動(dòng)進(jìn)樣器 ? 20位自動(dòng)進(jìn)樣器，可容納一個(gè) 20位消化管架 ? 250ml和 400ml消化管都可用于系統(tǒng) ? 將消化管架直接裝入進(jìn)樣器，不需要轉(zhuǎn)移消化管或消化好的樣品 KjeltecTM 8460 自動(dòng)進(jìn)樣器 ? 60位自動(dòng)進(jìn)樣器，可容納 3個(gè)20位消化管架 ? 250ml和 400ml消化管都可用于系統(tǒng) ? 將消化管架直接裝入進(jìn)樣器，不需要轉(zhuǎn)移消化管或消化好的樣品 KjeltecTM 自動(dòng)進(jìn)樣器 ? 可選 20 amp。 ? 彩色觸摸屏。 ? 可升級(jí)和 20或 60位自動(dòng)進(jìn)樣器連用，進(jìn)行無人值守的全
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