【正文】 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 4 由核磁共振數(shù)據(jù)計(jì)算蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu) (2)獲得蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的一組構(gòu)象集合 目前已有多種計(jì)算蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)的程序 ， 可以歸納為三大類計(jì)算方法 。 對于一些分子量相對較大的蛋白質(zhì) ， 還可定義一類上限值更大 ， 如 nm 的很弱NOE 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 4 由核磁共振數(shù)據(jù)計(jì)算蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu) (1)建立核磁共振波譜數(shù)據(jù)的約束文件 通常 NOE 距離約束的下限取兩個質(zhì)子的范德華半徑之和 nm。 這就構(gòu)成了距離約束文件和二面角約束文件 。 基于所輸入的蛋白質(zhì)氨基酸序列以及距離和二面角約束數(shù)據(jù)， 相應(yīng)的結(jié)構(gòu)計(jì)算軟件將構(gòu)建出蛋白質(zhì)分子的初始結(jié)構(gòu) ， 然后由分子動力學(xué)進(jìn)行能量最小化計(jì)算 ， 由此得到一組收斂的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的空間坐標(biāo) 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 4 由核磁共振數(shù)據(jù)計(jì)算蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu) 由核磁共振實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)的流程示于圖 511中 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 3 由波譜參數(shù)提取蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息 (2)反映主鏈和側(cè)鏈構(gòu)象的扭轉(zhuǎn)角 蛋白質(zhì)主鏈和側(cè)鏈上的核磁矩之間通過 3 個單鍵的 J 耦合常數(shù)是確定蛋白質(zhì)骨架和側(cè)鏈溶液構(gòu)象的最主要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 。NOE 信號強(qiáng)度也相應(yīng)地分為 強(qiáng) NOE 、 中 NOE 和弱 NOE 。 由波譜參數(shù)需要提取蛋白質(zhì)的如下結(jié)構(gòu)信息 (1)反映結(jié)構(gòu)特征的質(zhì)子對間距離 由 NOE信號強(qiáng)度可以導(dǎo)出蛋白質(zhì)的質(zhì)子對間的距離 ， 這是計(jì)算蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)的最主要的實(shí)驗(yàn)依據(jù) 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 3 由波譜參數(shù)提取蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息 核磁共振波譜譜峰提供的波譜參數(shù)包含著如實(shí)反映分子結(jié)構(gòu)的豐富信息 。 氨基酸殘基的 lH、 13C和 15N核的化學(xué)位移將取決于核所處的具體結(jié)構(gòu)環(huán)境而擁有不同數(shù)值 。 現(xiàn)在 ， 核磁共振波譜的化學(xué)位移用無量綱量 ?表示 。 如果是抗磁性屏蔽作用 ， 則原子核實(shí)際感受到的磁場將小于外加磁場 H0， 于是產(chǎn)生 核磁共振譜線的化學(xué)位移 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 (3)化學(xué)位移 在給定的射頻頻率下 ， 引起原子核共振躍遷的磁場強(qiáng)度 H 并不等于外加磁場 H0， 而是受核外電子云的屏蔽作用影響 。 J 耦合常數(shù)大小主要與連接兩個核的化學(xué)鍵數(shù)目有關(guān) ， 與影響標(biāo)量耦合核之間電子云分布的因素 ， 如單鍵或雙鍵 ，立體化學(xué)等與分子結(jié)構(gòu)有著密切關(guān)系的因素有關(guān) ， 而與外加磁場的大小無關(guān) 。 核自旋 自旋耦合是兩個由化學(xué)鍵連接的原子核的磁矩通過核外圍電子間的磁相互作用而產(chǎn)生的標(biāo)量耦合 ， 分子內(nèi)部原子核的這種磁相互作用影響了原子核在核能級間的共振躍遷能量 （ 或共振頻率 ） ，使得核具有不同的躍遷能量 ， 導(dǎo)致核共振譜峰分裂為多重峰 。 此外 ， 蛋白質(zhì)分子中氫鍵的確定可以提供形成氫鍵的供體與受體原子之間的距離 。 偶極耦合核自旋對之間的交叉弛豫不僅依賴于誘發(fā)弛豫的分子運(yùn)動過程 ， 同時也與偶極耦合核自旋對之間的距離密切相關(guān) 。 不同核之間的偶極 偶極弛豫 ， 分子內(nèi)部運(yùn)動以及化學(xué)交換過程都可產(chǎn)生核自旋間的 交叉弛豫 。 此外 ， 化學(xué)位移 等參數(shù)也用于結(jié)構(gòu)的優(yōu)化 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 核磁共振波譜的譜峰包含有相當(dāng)豐富的與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)信息相關(guān)的波譜信息 ， 它們由波譜參數(shù)表示 。 如果同時將射頻磁場 H1作用到原子核系統(tǒng)上 ， 當(dāng)射頻場頻率 ?滿足關(guān)系式： ?=?H0， 原子核將吸收射頻場能量從低能級躍遷到高能級 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 1 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息 2 核磁共振的波譜信息 在組成蛋白質(zhì)分子的基本元素 H、 C、 N、 O中 ， 原子核自旋量子數(shù) I=1/2的核 1H、 13C、 15N是多維核磁共振檢測的主要對象 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 所以 ， 對蛋白質(zhì)溶液樣品進(jìn)行各種類型的同核或異核核磁共振實(shí)驗(yàn) ， 處理并分析這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) ， 由核磁共振的波譜參數(shù)提取相應(yīng)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息 ， 建立用于蛋白質(zhì)溶液三級結(jié)構(gòu)計(jì)算的數(shù)據(jù)文件 ， 最后運(yùn)用相應(yīng)的結(jié)構(gòu)計(jì)算軟件導(dǎo)出被測定的蛋白質(zhì)的溶液空間結(jié)構(gòu) ， 就是多維核磁共振方法確定蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)的 基本步驟 。 其基礎(chǔ)在于該方法是在組成蛋白質(zhì)的元素 ， 即碳 、 氫和氮原子水平上檢測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息 。 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 多維核磁共振方法是通過各種類型的多維脈沖程序所執(zhí)行的核磁共振實(shí)驗(yàn) ， 間接提取蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息 ， 進(jìn)而用于計(jì)算機(jī)完成結(jié)構(gòu)運(yùn)算而獲得蛋白質(zhì)的溶液三維結(jié)構(gòu) 。 異核核磁共振方法除了要求蛋白質(zhì)可溶性和高穩(wěn)定性外 ， 蛋白質(zhì)分子必須要進(jìn)行 13C和 15N同位素富集 ， 也就是核磁共振樣品必須是 13C和 15N穩(wěn)定同位素雙標(biāo)記 的蛋白質(zhì) 。 對于 ?類型的蛋白質(zhì) ， 或二級結(jié)構(gòu)單元主要是 ?折疊的蛋白質(zhì) ， 則運(yùn)用二維同核核磁共振方法可以確定分子量在一萬左右的此類蛋白質(zhì)的溶液結(jié)構(gòu) 。 所謂 二維同核核磁共振實(shí)驗(yàn) ， 就是檢測組成蛋白質(zhì)的元素成分之一 ， 即 氫原子核 的二維核磁共振信號 。 前兩者發(fā)展出生物巨分子的質(zhì)譜分析 ， 后者發(fā)展出解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的NMR。thrich 2022年諾貝爾化學(xué)獎頒給對發(fā)展生物巨分子的鑒定與結(jié)構(gòu)分析之方法有重大貢獻(xiàn)的 John B. Fenn 、 田中耕一和 Kurt W252。thrich 教授實(shí)驗(yàn)室首次運(yùn)用核磁共振方法解析了胰高血糖素 （ glucagon） 多肽的溶液構(gòu)象 ，并在 1985 年運(yùn)用二維同核核磁共振方法確定了蛋白醉抑制劑 Ⅱ a 的溶液三維結(jié)構(gòu)以來 ， 至 2022 年 4 月PDB 庫中已有 2 293 個蛋白質(zhì)溶液三級結(jié)構(gòu) 。 Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.181 多維核磁共振波譜技術(shù)是目前唯一能夠用以測定蛋白質(zhì) （ 或核酸 ） 溶液三維結(jié)構(gòu) 的方法 。 50多年來 ， 核磁共振已發(fā)展成為一門有完整理論的新學(xué)科 。 ■ 六 、 結(jié)構(gòu)模型精化 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 路漫漫其修遠(yuǎn)兮 …… ?核磁共振的方法與技術(shù)作為分析物質(zhì)的手段 ， 由于其 可深入物質(zhì)內(nèi)部而不破壞樣品 ， 并具有迅速 、 準(zhǔn)確 、 分辨率高等優(yōu)點(diǎn) 而得以迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用 ，已經(jīng)從物理學(xué)滲透到化學(xué) 、 生物 、 地質(zhì) 、 醫(yī)療以及材料等學(xué)科 ， 在科研和生產(chǎn)中發(fā)揮了巨大作用 。 R因子是結(jié)構(gòu)振幅觀測值和計(jì)算值一致性的一個度量 。 但有了位相以后 ， 全自動化建立一個精確的結(jié)構(gòu)模型仍是一個巨大的挑戰(zhàn) 。 當(dāng)獲得了部分原子結(jié)構(gòu)模型時 ， 往往利用這部分信息計(jì)算位相 ， 或加入這種位相 （ 與實(shí)驗(yàn)位相結(jié)合 ） 去計(jì)算電子密度圖 。 ■ 五 、 電子密度圖詮釋 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 3 分析電子密度圖 首先應(yīng)對圖做一個評估 ， 考察數(shù)據(jù)和位相是否足夠精確到能產(chǎn)生一張可分析的電子密度圖 。 nm 左右分辨率的圖往往可以正確解出蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并給出原子模型 ， 并且可以分析晶體中有序水的結(jié)構(gòu) 。 對一般結(jié)構(gòu)來說 ， nm分辨率以上的圖才有可能分析出肽鏈走向 ， 特別是有一級結(jié)構(gòu)的信息 ， 這項(xiàng)工作容易進(jìn)行 ， 側(cè)鏈往往也能加上 。 此外 ， 結(jié)構(gòu)測定中所指的分辨率主要是說明在富里哀加和中所包含的衍射點(diǎn)的數(shù)目 ， 但說明衍射點(diǎn)質(zhì)量的參數(shù)并不多 ， 這一點(diǎn)必須明白 。 蛋白質(zhì)原子間距離在 nm 上下， 所以在這個分辨率下的圖原則上就達(dá)到了原子分辨率水平 。 還有一種廣泛用于二維圖像和照片的修飾方法稱為 網(wǎng)格圖 （ histogram ） 修飾法 ， 也可用于電子密度圖的修飾 。 這一步驟可通過程序反復(fù)多次 ， 直到計(jì)算電子密度圖的位相收斂為止 。 ■ 五 、 電子密度圖詮釋 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 1. 電子密度修飾 最通常使用的電子密度修飾方法是 溶劑平滑法 （ solvent flattering)， 它基于由誤差擾動產(chǎn)生的蛋白質(zhì) ‘ 溶劑 ’ 區(qū)應(yīng)該到處都一樣的原理 。 在未計(jì)算電子密度圖之前還要考慮電子密度圖的 分辨率 ， 不同的分辨率對結(jié)構(gòu)的表現(xiàn)不同 ， 解釋的方法也不同 。 電子密度圖是晶體結(jié)構(gòu)分析的直接結(jié)果 ，它包含了結(jié)構(gòu)的全部信急 ， 如何從一套電子密度圖分析出這些信息 ， 尚有一系列問題需要解決 。 在求解位相這一步 ， 有個叫 SOLVE 的程序已經(jīng)可以用來全自動解位相。 目前的軟件還只能使用第一個衍射圖像來評估預(yù)測晶體的幾何形狀等因素 。 這些程序全都能辨識各種探頭探側(cè)的數(shù)據(jù)格式 ， 可以在收集數(shù)據(jù)的現(xiàn)場進(jìn)行數(shù)據(jù)掃描和處理數(shù)據(jù) 。 現(xiàn)有的程序已經(jīng)相當(dāng)好 ， 自動化程度已相當(dāng)高 ， 使用方便 ， 速度也很決 。 氪的應(yīng)用尚不多 ， 但已有了初步印象 ， 它和氙占有同類位臵 ， 但為了達(dá)到相同占有率 ， 壓力要求偏高 。 這種重原子衍生物同晶度非常好 ， 而且占有率和占有位可以受壓力的控制 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 ④ 惰性氣體氙和氪 可以在常溫下加壓于毛細(xì)管中 ， 使毛細(xì)管中的晶體結(jié)合這些惰性氣體并生成重原子衍生物 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 雖然占有率不高 ， 但這一弱點(diǎn)恰恰被第三代同步加速器的高能量 、 細(xì)聚焦的優(yōu)點(diǎn)所彌補(bǔ) ， 收集高精度的反常散射數(shù)據(jù)可以使它提供位相信息 。 ③ 一個很有發(fā)展前途的方法是使用 鹵族元素 在晶體低溫冷凍的過程中浸泡 ， 如溴或碘 ， 已經(jīng)有幾個結(jié)構(gòu)通過這種浸泡獲得了重原子衍生物 ， 再使用 MAD法解出了結(jié)構(gòu) 。 但反過來 ， 如果蛋白質(zhì)不是由細(xì)菌表達(dá)的 ， 而本身又不含有蛋氨酸 ， 那就會遇到麻煩 。 在這種情況下 ， 一個重原子衍生物或者更簡單地說一個晶體就可以解結(jié)構(gòu)了 。 可喜的是 ， 在過去的 10余年中 ， 已經(jīng)發(fā)展出了一些可以應(yīng)用的方法 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 多波長反常散射法解結(jié)構(gòu)成為可能首先與第三代同步加速器輻射的發(fā)展和應(yīng)用分不開 ， 而第三代同步加速器輻射又以其光強(qiáng)度的提高和光束的更細(xì)聚焦為特點(diǎn) 。 應(yīng)用這一方法 ， 只需 一個晶體 就可以收集到全部衍射數(shù)據(jù)并解出結(jié)構(gòu) ， 這對結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究的大批量解析蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的需求 ， 無疑是一個最重要的方法 。 酶與底物的絡(luò)合是動態(tài)進(jìn)行的 ， 底物形成產(chǎn)物后會脫離酶 ， 所以如何穩(wěn)化 ? 酶 底物 ? 或 ? 酶 產(chǎn)物 ? 絡(luò)合物是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵 。 結(jié)構(gòu)經(jīng)修正后可以精確地顯示酶與底物的結(jié)合 ， 其中包括底物的結(jié)構(gòu)和酶結(jié)合后的結(jié)構(gòu)變化 ， 是一種最簡單的解結(jié)構(gòu)的方法 。 個別時候不同種屬的蛋白質(zhì)長出的晶體和已知結(jié)構(gòu)的該蛋白質(zhì)晶型一樣 （ 少有 ！ ) ， 更多的時候是在結(jié)晶狀態(tài)下 ， 該蛋白質(zhì)（ 酶 ） 和它的底物發(fā)生反應(yīng) ， 相對蛋白質(zhì)來說 ， 底物的大小是微不足道的 ， 或者免疫蛋白抗體和抗原決定簇 (小肽 )的結(jié)合 …… 這種不改變結(jié)晶狀態(tài)的情況下 ， 已知母體的結(jié)構(gòu) ， 若想求得酶和底物結(jié)合生成的絡(luò)合物結(jié)構(gòu) ， 使用差值電子密度法是最好不過了 。 So， 分子臵換法已逐步獲得廣泛的應(yīng)用 ， 是同晶臵換法的一個重要助手 。 使用分子臵換法解結(jié)構(gòu)無需制備重原子衍生物 ，只需衍射強(qiáng)度數(shù)據(jù)就可以了 ， 大大地節(jié)約了時間和精力 。 對天然蛋白質(zhì)的改造和修飾甚至借助于天然分子骨架構(gòu)建新的蛋白質(zhì) ， 也有望使用這種方法解出結(jié)構(gòu) 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 3 分子臵換法 如果一個蛋白質(zhì)分子與另一個已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子近似 ， 這種近似粗略地可以從一級結(jié)構(gòu) （ 蛋白質(zhì)的氨基酸順序 ） 加以判斷 ， 比如說至少有 50％ 的近似性 ， 就可以考慮使用分子臵換法解決位相問題從而解出未知結(jié)構(gòu) 。 如果已經(jīng)獲得了一個較好的重原子衍生物 ， 用它的同晶加上反常散射信息就可計(jì)算出一套母體位相 ， 然后使用母體位相 ， 較差的重原子衍生物與母體的結(jié)構(gòu)振幅之差為系數(shù)進(jìn)行富里哀加和， 這種圖上可以直接顯示重原子位臵 ， 應(yīng)該比帕特森分析簡單而且更靈敏 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 (2)重原子位臵確定 —— 帕特森 （ Patterson） 分析 這是一個以帕特森名字命名的函數(shù) ， 在數(shù)學(xué)上稱為卷積 ，