【正文】 高表面密度和長的 PEG 鏈對降低蛋白質(zhì)對脂質(zhì)體的吸附是必要的，表面密度在空間位阻和范德華力上的影響比鏈的長度影響更大。國外學者提出的固體對蛋白質(zhì)排斥理論模型，對空間位阻、范德華力和親水作用都進行了廣泛而深入的研究。 研究表明，用 PEG 及非離子表面活性劑包衣的脂質(zhì)體被肝、脾攝取減少，脂質(zhì)體在體內(nèi)循環(huán)時間延長。 4． 研究現(xiàn)狀 （ 1） 高分子 表面修飾的脂質(zhì)體 [55] 常用的高分子有聚乙二醇（ PEG）、混合磷脂、非離子表面活性劑、 IgA 及血清成分等，其主要目的是提高脂質(zhì)體表面的親水性，降低脂質(zhì)體與調(diào)理素間的相互作用。 （ 5）特異性配體的缺乏 機體對外來異 物作用時，除非特異性吞噬作用外，還存在特異性的受體 (包括免疫球蛋白、補體等 )介導的過程。粒徑的大小可以用于控制微粒制劑的靶向性，同時粒徑大小也能影響對其進行長循環(huán)表面修飾的程度。某些帶正電荷粒子可在被肝攝取后重新分配到脾而不是肝。 191 （ 3）調(diào)整ζ電位 一般來講，極性微粒不易被吞噬，ζ電位 越高，被吞噬越少。在長循環(huán)脂質(zhì)體研究中，聚乙二醇化 (PEGs)脂質(zhì)體的長循環(huán)機制之一即是立體位阻效應。血漿中成分（例如調(diào)理素）更易于與疏水性表面結合， 調(diào)理作用可產(chǎn)生疏水性更強的表面，疏水性很強的粒子不需要被調(diào)理就可以被吞噬，因而提高表面親水性可以抑制調(diào)理作用。長循環(huán)脂質(zhì)體目前主要有剛性脂質(zhì)體，表面修飾脂質(zhì)體和其它類型，這類脂質(zhì)體可能是因為某些能自我識別的分子與脂質(zhì)體結合后，能起到保護脂質(zhì)體不被 RES 識別的作用（見圖 68[54]）。有人將神經(jīng)節(jié)苷酯摻入二硬脂酸胞苷，所制備的脂質(zhì)體在磷酸緩沖液和血漿中 24 小時后僅釋放包封藥物的25％。實驗證明，含5％ ~15％摩爾 GM1 的脂質(zhì)體血中滯留量明顯增高，半衰期大大延長。 3．實現(xiàn)長循環(huán)的途徑 最初研究長循環(huán)脂質(zhì)體主要是從生物學角度考慮，制備血循環(huán)中長壽命的脂質(zhì)體。很明顯，脂質(zhì)體表面被糖脂或不同聚合物修飾后，生物分子與脂質(zhì)體的碰撞速率降低，可用公式來表示： F= P0PP / P0， F 為立體因子，與濃 度無關； PP 和 P0 分別表示長循環(huán)脂質(zhì)體和脂質(zhì)體的碰撞幾率。 分子拉鏈的保護機理可以用化學動力學和熱力學來解釋?？墒窃摲肿永湵旧砭哂猩砘钚裕ㄈ缱R別糖脂，和天然凝集素鍵合等），從而影響脂質(zhì)體的生物功能。 RP：識別蛋白； k1：脂質(zhì)體與 RP1結合的動力學常數(shù)。盡管其化學結構不同，但它們有一個共同點，即在脂質(zhì)體表面能形成一個親水的伸展 的分子拉鏈。然而整個吞噬過程同酶催化反應相似。吞噬過程很復雜，至少包括兩個階段，即激發(fā)階段和胞飲階段。該動力學過程可以用經(jīng)典的化學反應來描述（圖 67[53]）。這種快速而有效的清除包括兩個過程：首先，血漿成分（如血漿蛋白、脂蛋白、纖維蛋白、免疫蛋白、補體 C 等）包裹粒子而使之可被吞噬細胞識別即調(diào)理過程。所謂長循環(huán)脂質(zhì)體就是靜脈注射給藥后，能夠躲避 RES 的攝取而在血液循環(huán)系統(tǒng)中長時間滯留，進而可到達非 RES 系統(tǒng)的靶向載藥系統(tǒng)。雖然可以預先用空白脂質(zhì)體或硫酸葡聚糖等巨噬細胞抑制劑抑制 巨噬細胞的吞噬作用，從而降低肝臟對脂質(zhì)體的攝取，但這對機體防御功能不利。載藥脂質(zhì)體進入血管后，靶向作用于 RES 系統(tǒng)，這對于治療 RES 系統(tǒng)疾病（如內(nèi)臟利什曼病、細胞內(nèi)感染）有特殊的意義。圖 66 [52]進一步說明了不同類型的陽離子脂質(zhì)體 DNA 復合 物小鼠靜脈注射后在組織中的靶向性及其轉染效率。 GalC4chol/DCchol/DOPE(2： 2：6) DNA 復合物通過人體肝 HepG2 細胞中唾液酸糖蛋白缺乏受體高效識別，其轉染效率和 DNA 攝取率明顯高于 DCchol/DOPE（ 4:6） DNA 復合物。 糖基化脂質(zhì)體的制備可以采用脂蛋白包衣或者是將糖脂融合到脂質(zhì)體的表面，糖脂的化學結構、分子量和理化性質(zhì)對轉染效率的影響很大。②電荷，糖基化陽離子脂質(zhì)體 質(zhì)粒 DNA 復合物所帶的正電荷不能太高，否則不易與受體結合。 肝細胞唾液酸糖蛋白缺乏受體、巨噬細胞和肝實質(zhì)細胞中的甘露糖受體特別適合于脂質(zhì)體介導的特異性基因轉移。可以將外源 DNA 轉運到特定的細胞中，所使用的配體包括半乳糖、甘露糖、 188 乳糖、轉鐵蛋白、內(nèi)皮細胞生長因子和抗原等等。因此，必須開發(fā)新型的具有特異靶向性的載體系統(tǒng) [48]。 ） mV。 ） mV, 而 PC 為（ 177。因此在具體研究中，必須對其分子量進行篩選。 3．聚陽離子脂質(zhì)體（ PCL） [47] 同陽離子脂質(zhì)體相比，聚陽離子脂質(zhì)體可以更有效地將陽離子脂質(zhì)體 DNA 復合物轉運到胞內(nèi)，且細胞毒性和溶血活性小。對處于有絲分裂期的細胞而言，由于核膜已經(jīng)破裂，質(zhì)粒 DNA 容易進入核內(nèi)；對于非分裂期細胞而言，質(zhì)粒 DNA 能否進入核內(nèi)是轉染能否成功的關鍵。 Xu 等 [46]認為質(zhì)粒 DNA從陽離子脂質(zhì)體 DNA 復合物的釋放發(fā)生于復合物與核內(nèi)體融合的時候；但也有人認為，陽離子脂質(zhì)體 DNA 復合物從核內(nèi)體中脫離出來時并未分解，質(zhì)粒 DNA 從復合物的釋放應發(fā)生在此后的階段。如果將陽離子脂質(zhì)體DNA 復合物微量注射至細胞核內(nèi)，或將裸露的 DNA 直接注入胞漿中部不能對細胞有效轉染，而將質(zhì)粒 DNA 直接注入細胞核中卻獲得很高的基因表達。在胞質(zhì)內(nèi)，細胞通過微管網(wǎng)狀結構或肌動蛋白微絲等主動轉運系統(tǒng)將含 DNA的微粒系統(tǒng)轉移至核周圍。 ③ DNA 向核周圍的轉運 當陽離子脂質(zhì)體 DNA 復合物從核內(nèi)體中脫離以后，如何將 DNA 轉移至細胞核周圍成為一個新問題。在 DNA 從核內(nèi)體的脫離過程中，脂質(zhì)的融合起到十分重要的作用。 ②陽離子脂質(zhì)體 DNA 復合物脫離核內(nèi)體 質(zhì)粒 DNA 通過細胞內(nèi)吞作用進入細胞后必須從核內(nèi)體 (endosome)中脫離出來才能對細胞進行轉染，否則 DNA 將隨核內(nèi)體移至溶酶體，被大量的核酸酶降解，使轉染失敗。目前認為陽離子脂質(zhì) 體 DNA 復合物進入細胞有三種模式： (1)與細胞表面發(fā)生非特異性結合； (2)通過細胞內(nèi)吞作用進入，隨后與核內(nèi)體膜發(fā)生融合； (3)通過細胞質(zhì)膜上形成的小孔進入。這是因為肺毛細血管是陽離子脂質(zhì)體 [32P]DNA 復合物靜脈注射后面臨的第一個“陷阱”。盡管在血流中確實發(fā) 生脂質(zhì)復合物的聚集，但由于聚集體的直徑通常在 lμ m 以下，比正常的紅細胞體積還小，因此很可能通過細胞內(nèi)吞作用而被攝取，內(nèi)皮細胞上表達的針對變性白蛋白的受體可能參與這一過程。已知血漿中的白蛋白會吸附到陽離子脂質(zhì)體 DNA 復合物上，使復合物的 Zeta 電位降低，減少復合物之間的電荷排斥力，導致復合物的聚集 [45]。 （ 2） 陽離子脂質(zhì)體 DNA 復合物與細胞外物質(zhì)的相互作用 當陽離子脂質(zhì)體 DNA 復合物進入體內(nèi)后，它將同細胞外的一些物質(zhì)發(fā)生相互作用。起始時，脂質(zhì)體與 DNA 分子結合在核酸周圍形成群集的囊泡；當達到臨界脂質(zhì)濃度時， DNA 誘導的脂質(zhì)體融合和脂質(zhì)體引起的 DNA 萎縮開始發(fā)生，最終形成了脂質(zhì)包裹的 DNA 復合物。這也是 DOPE 成為“脂質(zhì)伴侶”的原因。絕大多數(shù)陽離子脂質(zhì)體需要一種中性的脂質(zhì)（如 DOPE）來達到最佳的轉染效果。從 Lα 到 HH 相轉變過程中，脂質(zhì)最有利的分子構型是錐狀，如小的極性頭和大的疏水烴鏈，而圓柱狀的脂質(zhì)有利于形成層狀構型，細胞融合 吞飲作用 DNA 放釋放 溶酶體 核內(nèi)體 細胞融合 吞飲作用 核內(nèi)體 溶酶體 DNA 釋 放 轉錄 核攝取 核內(nèi)體 翻譯 陽離子脂質(zhì)體 復合物 蛋白質(zhì) 圖 65 陽離子脂質(zhì)體轉移基因圖 186 反錐狀的脂質(zhì)（大的極性頭部和小的疏水鏈）則形成膠束結構。極性頭部的有效體積大小還受靜電排斥力和氫鍵的進一步影響?，F(xiàn)已證明在六方晶相脂質(zhì)的頭部，基因呈高度彎曲的形狀。 Liczinger 等 [43]研究了脂質(zhì)體在水中的多種形態(tài)，證明脂質(zhì)最重要的兩種形態(tài)是 Lα 相和 HH 相，Lα 相是一種具有流動性烴鏈的層狀結構，而 HH 相是一種二維的六方晶相結構。它能被某些因素所誘發(fā)，如一些脂質(zhì)、肽類或 pH 值變化。該復合物的直徑在 m~ m 時，轉染效率最高；其次是直徑在 m~μ m 范圍內(nèi) , 直徑在 400nm 以下的復合物轉染效率最低。 (1) 陽離子脂質(zhì)體與基因形成復合物 質(zhì)粒 DNA 可以被包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，或者與脂質(zhì)體表面借靜電作用形成復合物。為了使 DNA 在細胞內(nèi)高效表達，體外陽離子脂質(zhì)體 基因復合物的正負電荷比約為 2： 1。 首先，陽離子脂質(zhì)體與帶負電的基因通過靜電作用形成脂質(zhì)體 基因復合物，此復合物因陽離子脂質(zhì)體的過剩 而帶正電；帶正電的脂質(zhì)體 DNA 復合物由于靜電作用吸附于帶負電的細胞表面，然后 185 通過與細胞膜融合或細胞的內(nèi)吞作用進入靶細胞。結構分析顯示，這種陽離子聚多肽脂質(zhì)體為一電荷密集的、脂質(zhì)含量高、粒徑小于 100nm 的球形納米粒 [40,41]。同 PLL 相比，硫酸魚精蛋白的分子量?。?MW=4000； PLL 的 MW=18500）；分子中含有 21 個精氨酸殘基，帶有很強的正電荷；硫酸魚精蛋白是一種天然蛋白， FDA 批準其作為肝素 誘導抗凝血作用的解毒劑。其原理可能是因為 PLL和 DNA 之間的相互作用很強，可以形成濃縮的納米粒子，脂質(zhì)殼位于納米粒子的表面 [38]。 許多陽離子脂質(zhì)體，特別是由單價脂質(zhì)組成的陽離子脂質(zhì)體，無法濃縮 DNA，從而導致脂質(zhì) DNA復合物異質(zhì)分布，影響脂質(zhì)體的轉染效率 。目前，許多公司都推出了商品化的脂質(zhì)體試劑，常用的有 Lipofection、 SA、 DOGS 及 DOTMA。但眾多的實驗結果表明，利用病毒載體和脂質(zhì)體介導的基因轉移是最有前途的方法，后者已被美國癌癥協(xié)會批準為臨床基因治療的第一方案?；蛑委煹年P鍵技術，是能將外源目的基因轉移到人體內(nèi)并能有效適度表達?；蛑委煟?Gene therapy）是指將遺傳物質(zhì)（即 DNA）轉入人體細胞，并整合至染色體中，取代突變基因，補充缺失基因或關閉異?；?，從而達到治療機體疾病或有益于治療的目的。陽 離子脂質(zhì)的疏水錨著區(qū)的主要功能是既為脂質(zhì)雙層提供足夠的流動性，又能使脂質(zhì)雙層膜維持一定的剛性，以便為陽離子脂質(zhì)體與體內(nèi)的脂質(zhì)融合創(chuàng)造條件。含胺類基團的極性頭部起著脂質(zhì)體與 DNA、脂質(zhì)體 DNA 復合物與細胞膜或細胞內(nèi)其它組分相互結合的作用；隔離區(qū)的鏈長和鍵長則影響陽離子脂質(zhì)體與粘膜表面的相互作用，進一步影響轉染效率；連接鍵決定了陽離子脂質(zhì)體的化學和生物穩(wěn)定性，一般要求陽離子脂質(zhì)體既有一定的化學穩(wěn)定性，又易在體內(nèi)被生物降解、減少細胞毒性。天然堿性脂目前主要為十八烷胺 (SA)。脂質(zhì)衍生物主要是由磷脂酰乙醇胺、膽固醇、二?；视偷韧ㄟ^一個可降解的酯鏈接上一個陽離子基團而形成，帶正電。陽離子去垢劑主要有 N[1(2， 3)二油烯氧基 ]丙基 N， N， N三甲基氯化銨（ DOTMA）、十二烷基三甲基溴化銨、十四烷基三甲基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨、十六烷基二甲基乙基溴化銨、二甲基雙十八烷基溴化銨 (DDAB)、 N (α 三甲基乙?；?) 雙十二烷基 D谷氨酸、 1， 2二油烯氧基 3三甲胺基丙烷 (DOTAP)等。 陽離子脂質(zhì)體 1．陽離子脂質(zhì)體的結構形式 陽離子脂質(zhì)體通常由一種陽離子親水脂分子和二油?；字Ｒ掖及罚?DOPE）組成， DOPE 作為“脂質(zhì)伴侶”是形成穩(wěn)定的單脂雙層陽離子脂質(zhì)體所必需的。關于脂質(zhì)體文獻報道的內(nèi)容很多，也有專著介紹。 另外，有的文獻也按制備方法來分類，如 REV（ reverseevaporation vesicles）指用逆相蒸發(fā)法制備的脂質(zhì)體； DRV（ driedreconstituted vesicles）指干燥重建法制得的脂質(zhì)體； MVL（ multivesicular liposomes）即多室脂質(zhì)體等等。 （ 3）大單層脂質(zhì)體（ large unilamellar vesicles， LUV） 這是指直徑大于 1000nm 的由單層磷脂雙分子層膜組成的脂質(zhì)體。 （ 2）小單層脂質(zhì)體（ small unilamellar vesicles， SUV） 這是具有脂質(zhì)雙分子層的最小單位，其大小根據(jù)介質(zhì)的離子強度和膜的脂質(zhì)組成不同而不同，因此作為藥物的載體受到限制。這些脂質(zhì)體大小范圍較寬，一般從 100nm~1000nm 不等，組成 MLV 的磷脂雙分子層有五層或更多，層數(shù)較少的的有時也稱為少層脂質(zhì)體（ oligolamellar liposomes）。根據(jù)用途對脂質(zhì)體粒徑的特定要求，不同大小脂質(zhì)體?？梢圆捎貌煌闹苽浞椒?。脂質(zhì)體的直徑約在 25nm~1000nm 范圍內(nèi)，甚至更大。從圖中可以看出它們的一些基本特點，普通脂質(zhì)體一般呈中性，陽離子脂質(zhì)體帶正電荷，通過單鍵、雙鍵和多重鍵結合；長循環(huán)脂質(zhì)體主要由高分子物質(zhì)或葡萄糖醛酸等物質(zhì)修飾；免疫脂質(zhì)體是含有抗體或抗體片段的長循環(huán)脂質(zhì)體。研究人員可以根據(jù)不同的目的對脂質(zhì)體進行修飾。 5． 擴大性：如果藥物是抗原，脂質(zhì)體還可作為疫苗的免疫佐劑。 3． 保護性：藥物被脂質(zhì)體包封 后，受到脂質(zhì)體雙層膜的保護，可以顯著提高穩(wěn)定性，同時，還免受體內(nèi)的降解酶和免疫系統(tǒng)的分解，提高藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性。 2． 長效性：脂質(zhì)體作為藥物的載體具有長效作用。同其他的藥物載體系統(tǒng)相比，脂質(zhì)體具有以下作用特點