【正文】 并對余成元學(xué)弟在實(shí)驗(yàn)過程的幫助表示感謝。 并衷心的感謝院領(lǐng)導(dǎo)和大學(xué)四年來帶所有的帶課老師。在此，向郭 老師 表示衷心的感謝。為 了 實(shí)驗(yàn) 的順利進(jìn)行 郭老師 給予了莫大的幫助?；仡?實(shí)驗(yàn) 的全過程， 在選題、準(zhǔn)備、收集和做論文的整個(gè)過程中都得到 郭 老師的悉心指導(dǎo)。 通過丙酮沉淀蛋白質(zhì)的方法，對鹽藻胞外蛋白進(jìn)行粗提取，將粗提取的蛋白質(zhì) 通過薄板層析進(jìn)一步提純，可以看出 鹽藻 胞外蛋白有兩大類蛋白質(zhì) Rf 值分別為 和 ，對遷移率為 的蛋白質(zhì)進(jìn) SDS— PAGE 可以得到 3 條帶， 泳距分別是 mm， mm， mm，其對應(yīng)的分子量分別是 34600， 22900，和17800。但現(xiàn)在主要是其利用胞內(nèi)蛋白作為添加劑生產(chǎn)海藻型蛋白質(zhì)飼料 ， 現(xiàn)在 需要 進(jìn)一步 研制出 一系列更 合理有效利用 鹽藻胞內(nèi)蛋白 的技術(shù)，提高其附加值。這方面的資料比較少，還需要我們在以后的學(xué)習(xí)和研究中進(jìn)一步了解 。在對 Rf值 為 的蛋白質(zhì)進(jìn)行 SDS— 聚丙烯凝膠電泳和測定分子量時(shí)，發(fā)現(xiàn)所測得的三個(gè)分子量值與鹽藻胞內(nèi)分子量有一定的接近 [17]。本實(shí)驗(yàn)以鹽藻為研究對象，研究其胞外蛋白質(zhì)的特性，在對鹽藻胞外蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行測定時(shí)發(fā)現(xiàn)其濃度不是太高，為 ，其中可能主要包括鹽藻分泌的蛋白質(zhì)和一些死亡的鹽藻的解體。鹽藻胞外蛋白樣品對應(yīng)的分子量分別是 34600，22900，和 17800。凝膠的厚度是 1mm，濃縮膠的電流是 10mA，分離膠的電流是 30mA，全程電泳時(shí)間為3h30min 。 實(shí)驗(yàn)表明，在薄層層析中， 層析效果 與制板的規(guī)格及程序、樣品的點(diǎn)樣量及毛細(xì)管內(nèi)徑、點(diǎn)樣量勻稱與 否有關(guān)，與展 層板 、展開方式也有一定的影響，應(yīng)是薄層層析分析中嚴(yán)格控制的條件 。表明鹽藻胞外蛋白質(zhì)的含量非常低，要想應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)還有一些不足。并測得混合物在吸光度 A595nm 的平均吸光值為 ，考馬斯亮藍(lán)法具有干擾少，簡便，靈敏，準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)而且重復(fù)性好。 （ 19） 根據(jù)蛋白質(zhì)在電泳當(dāng)中其分子量的對數(shù)值 (1gM)與其相對遷移距率 (mm)呈比例關(guān)系的原理 [15] [19] [20]，利用已知分子量蛋白質(zhì) (標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白 )在膠板上的遷移距離 ， 以分子量對遷移 距 率作圖，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線 ，再根據(jù)未知蛋白質(zhì)的遷移 距 率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上測定其分子量 。 （ 18）卸下橡膠框，取下凝膠板，記下染料在分離膠的遷移距離記做 Y，并在凝膠板切下一角做為標(biāo)記，將凝膠板置于大培養(yǎng)皿中，并向培養(yǎng)皿中加入染色液 ,將培養(yǎng)皿置于脫色搖床上，染色 1h， 回收 染色液 。 加樣時(shí)，將微量注射器的針頭通過電極緩淮海工學(xué)院二○○六屆畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 10 頁 共 16 頁 沖液伸入加樣槽內(nèi)，盡量接近底部，輕輕推動(dòng)微量注射器 。 表 6 SDS— 不連續(xù)體系凝膠配制 試劑名稱 配制 %分離膠所需 試劑用量 /ml 配制 3%濃縮膠所需 試劑用量 /ml 分離膠貯液 — 分離膠緩沖液 — 濃縮膠貯液 — 濃縮膠緩 沖液 — 10%SDS 1%TEMED 1 重蒸水 混勻后，置真空干燥器中，抽氣 10min 10%AP （ 15）處理樣品：取一 個(gè) EP 管加入 200μ L 樣品溶解液，同時(shí)加入 200μ L 蛋白樣品溶液輕輕的蓋上蓋子，在 100℃沸水浴中保溫 3min， 同時(shí)以同樣的條件處理標(biāo)準(zhǔn)蛋白， 取出搖勻， 冷卻后加樣，處理好的樣品暫時(shí)不用，可放在 — 20℃冰箱保存較長時(shí)間，使用前在100℃沸水中加熱 3min，以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合 。約 20min 后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合，傾去水封層的重蒸水，在用濾紙條吸去多余的水分。 (13)按表 6 配制 10ml %的分離膠，混勻后，用細(xì)長頭的滴管將凝膠液加至長短玻璃板間的縫內(nèi)，約 4cm 高，用注射器取少許重蒸水。 （ 12） 垂直平板電泳槽的安裝 ： 先把垂直平板電泳槽和兩塊玻璃板洗凈，晾干。 （ 10） 配制 ： 稱考馬斯亮藍(lán) R250 ， 加35%的乙醇 454mL,46mL 冰乙酸混勻， 過濾后 待 用。L1 Tris— molL1 HCl 48mL調(diào) 節(jié) pH 至 ，用玻璃棒引流至 100mL 的容量瓶中， 最后用重蒸水定容至 100mL， 4℃貯存 ，待用。 （ 8） 配制濃縮膠緩沖液（ L1 TrisHCl 緩沖液）： 用電子天平 稱 取三羥甲基氨基甲烷（ Tris） ， 置于燒杯中， 加少許重蒸水使其溶解，再加 1mol （ 6） 配制 10%濃縮膠貯液： 用電子天平 稱 取 丙烯酰胺 （ Acr） 10g 和 N, N’亞甲雙丙烯酰胺 (Bis)， 置于燒杯中 ， 加入適量 重蒸水 溶解，用玻璃棒引流至 100 mL 的容量瓶中， 最后定容至 100mL，過濾后置 于 棕色試劑瓶中， 4℃ 貯存 ，待用。 表 5 不連續(xù)體系樣品溶解液配制 SDS 巰基乙 醇 溴酚藍(lán) 蔗糖 L 1 TrisHCl 緩沖液： 用電子天平 稱取 Tris （ 三羥甲基氨基甲烷 ） ， 置于燒杯中， 加入 50ml 重蒸水，再中入約3ml 1molL 1 TrisHCl 緩沖液。最好臨用前配制。 （ 2） 配制 1%TEMED（ V/V）： 用移液槍取 1mLTEMED 注入燒杯中 ，加重蒸水至 100mL，攪拌均勻， 置 于 棕色瓶中， 4℃ 貯存 ，待用 。 鹽藻胞外蛋白質(zhì)的 電泳與分子量測定 （ 1）配制 10%（ W/V） SDS 溶液： 用電子天平 稱 取 5gSDS 置于燒杯中 ，加重蒸水至 50mL，微熱使其溶解，置 于 試劑瓶中， 4℃ 貯存 ，待用 。遷移率 Rf=斑點(diǎn)中心與原點(diǎn)之間的距離記 /原點(diǎn)與溶劑前緣之間的距離。用吹風(fēng)機(jī)將淮海工學(xué)院二○○六屆畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 8 頁 共 16 頁 薄層板吹干后，將薄層板置于 105℃的烘箱中約 20 分鐘，薄層板上出現(xiàn)紫紅色的斑點(diǎn)。 （ 11） 配 制 ％茚三酮 丙酮溶液：用電子天平稱取 水合 茚三酮 ，置于小燒杯中，然后向燒杯中加入 50mL 丙酮，用玻璃棒攪拌均勻。展開時(shí)間為 3h50min 展開距離約達(dá)到薄層板的 3/4 時(shí)，取出薄層板。 注意：每次所劃的樣不宜太多，要適宜均勻。 （ 9）從干燥器中取出 4 塊薄層層析板， 在薄層層析板下端距底邊 處用解剖針輕輕劃出一條線作為起始線 。 （ 7）配制樣品溶液：從試管中量取 5mL 蛋白質(zhì)溶液置于另一干凈的試管中，依次加入1ml95%的乙醇， 1 滴 6M 的 HCL，晃動(dòng)均勻。 （ 5）配制 6M 的 HCL：量取分析純 ,加蒸餾水定容至 10mL。 注意： 不能單用 硅膠 G 粉做支持物，否則風(fēng)干后的硅膠板易破碎。 （ 3）將糊狀硅膠 G 粉注在玻璃板的一端，輕輕左右搖動(dòng)，再上下擺動(dòng)，并輕輕敲打左右兩端及底部，至上下左右均己均勻后，放在干凈、通風(fēng)的水平工作臺(tái)上，自然干燥，即制成薄層層析板。 （ 2）電子天平稱取 羧甲基纖維素鈉，放入 100mL 燒杯中，加入 25mL 蒸餾水，利用加熱磁力攪拌器攪拌均勻。其中的溶液利用冷凍高速離心機(jī)離心（ 10000r/min,5min, 4 ℃） ，用 蒸餾水吹洗法 將取得的沉淀置于試管中，在冰箱下層保存待用。然后將燒杯置于冰箱下層，沉淀蛋白質(zhì) [12]。 （ 6）從三角燒瓶中取得 200 mL 鹽藻上清液，置于燒杯中。取干凈的具塞試管 4 支，按表 4 編號(hào)后，依次加入各種物質(zhì)。取的上清液，置入 500 mL 的三角燒瓶中，放入冰箱上層待用。 [9] (2)取六只三角燒瓶里培養(yǎng)的鹽藻倒入 1000 mL 的量筒中，量取 1000mL。白天光照強(qiáng)度 35001x。培養(yǎng)溫 度白天為 25℃，夜間 20℃。 取干凈的具塞試管 6 支，按表 3 編號(hào)后，加入各種物質(zhì)。 藥品 丙酮 國藥