檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的實驗技術(shù)(參考版)
2025-07-17 00:14本頁面
【正文】 如果報告基因正常表達，說明該cDNA文庫蛋白與已知的靶因子間可能有相互作用；反之，則說明兩者無相互作用。接著構(gòu)建一個融合表達載體，它含有待考察蛋白的基因序列與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的序列。首先需要構(gòu)建一段序列（黑框），它含有至少3個拷貝的特異的已知靶因子以及報告基因的序列。④ 酵母單雜交系統(tǒng)（in vivo）酵母單雜交系統(tǒng)的原理與雙雜交一樣，不同的是它主要用于考察cDNA文庫中的蛋白與DNA（即特異的已知靶因子）是否有相互作用。將膜取出，進行變性、復性和封閉（過夜），然后與放射性標記的DNA探針進行反應，最后洗膜、晾干并用膠片曝光。其原理和實驗流程如下圖所示，首先是用噬菌體（phage）侵染大腸桿菌，然后將這些大腸桿菌涂到平板上。其原理是與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA在NativePAGE膠（非變性膠）上比沒有結(jié)合蛋白的DNA移動速率要慢，因此通過電泳即可看到DNA的變化，如下圖所示。下圖中，由于待測蛋白與DNA結(jié)合的部位無法被DNase Ⅰ酶切降解，因此它的電泳結(jié)果中與直接用DNase Ⅰ進行處理的樣品相比，會缺少一段；如果待測蛋白與DNA無相互作用，那么這兩組的電泳結(jié)果應當一致。將DNA的一個3’端用32p標記，然后將DNA分成兩份，一份直接用DNase Ⅰ進行不完全酶切；另一份先與待測蛋白混合反應一段時間，然后再用DNase Ⅰ進行不完全酶切。通過離心將瓊脂糖珠沉降到管底，去除上清液，然后再用緩沖液將瓊脂糖珠沖洗數(shù)次，最后用western blot（或S
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