【導(dǎo)讀】六、投資與財務(wù)······································································&#1

　　

【正文】 和空白組的血清 HDL值沒有明顯差異 (P)如下表 3 表 3 各組大鼠血清膽固醇 (HDL 和 LDL)水平的比較 (X 土 s) 組別 樣品數(shù)量 HDL 值 (mmol\l) LDL 值 (mmol\l) 空白組 10 土 土 模型組 10 士 土 陽性對照組 10 士 土 A 10 士 士 B 9 士 土 C 9 士 土 D 10 士 土 E 8 士 土 F 10 士 土 結(jié)論：化合物 C有明顯降低小鼠低密度脂蛋白膽固醇（ LDL）對和高密度脂蛋白膽 固醇 （ HDL） ,并且降脂可以降到正常水平 。 對化合物 C相關(guān) 最大耐受量實驗研究 材料與方法 實驗動物 ： 昆明種小鼠 20 只 (雌雄各半 )，由河南省醫(yī)學(xué)動物實驗中心提供。 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 創(chuàng)業(yè)計劃書 第四屆挑戰(zhàn)杯 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 商業(yè)計劃 第 24 頁 藥物 ： 化合物 C 喂養(yǎng)與護理 ： 小鼠給予普通飼料 (購自河南省醫(yī)學(xué)動物實驗中心 )，自由飲水，每日更換飲水及飼料，保持動物生活環(huán)境通風(fēng)及清潔衛(wèi)生。 給藥方法 ： 小鼠連續(xù)觀察三天后，第四天給小鼠化合物 C 共兩次 。 觀察指針及方法 小鼠的最大耐受量倍 數(shù) :按最大耐受量倍數(shù)公式計算。 結(jié)果 ： 一般情況下，動物精神狀態(tài)良好，灌胃前后無明顯不良反應(yīng)。 小鼠的最大耐受量倍數(shù) 小結(jié) ： 小鼠的最大耐受量倍數(shù)大于 100 倍，化合物 C 治療高脂血癥安全、有效。 化合物 C的長期毒理研究 ：樣品化合物 C，實驗用 SD 大鼠由河南醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，體重范圍 : 60g75g。 ： 日立 7060C 全自動生化分析儀 : Ts212F 生物組織 自動脫水機 。BM 2V I 生物組織冷凍包埋機 。 Finesse325 石蠟切片機。 實驗方法：動物按體重隨機分成 4 組 , 每組 22 只 ,雄雌各半。試驗接受試物推薦用量的 2 50 和 100 倍 , 設(shè) 3 個劑量組；另設(shè)陰性對照組，每天上午灌胃一次，按照 1ml\50g高脂乳劑，自由進食飲水。實驗期間觀察動物形態(tài) , 每周稱重 , 記錄飼料消耗量。喂養(yǎng) 10d 后 , 摘眼球采血做血常規(guī)及生化指標(biāo)測定 , 對肝、腎、脾稱重 , 并取出肝、腎、脾、胃、腸做病理學(xué)檢查。 ：動物的一般表現(xiàn)、體重。血常規(guī)及生化指標(biāo) : 紅細(xì)胞計數(shù)、白細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、尿素 氮、肌酐、膽固醇、血糖、總蛋白、白蛋白。 病理解剖 : 臟體比、大體觀察及病理組織檢查 。 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法 ： 實驗數(shù)據(jù)以 Spss 軟件進行單因素方差分析。 一般形態(tài)觀察 ： 金銀花 3 個劑量組喂養(yǎng)的大鼠毛質(zhì)白 , 有光澤 , 外觀形態(tài)與陰性康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 創(chuàng)業(yè)計劃書 第四屆挑戰(zhàn)杯 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 商業(yè)計劃 第 25 頁 對照組比較無區(qū)別 , 也無死亡現(xiàn)象 。 ： 試驗結(jié)束時各劑量組體重、體重增重與對照組相比無顯著性差異 (p )。見表 1 3 個劑量組喂養(yǎng)大鼠 30d 后血紅蛋白含量、紅細(xì)胞計數(shù)、白細(xì)胞計數(shù)均正常值范圍內(nèi) (P) 各劑量組臟體比指標(biāo)與對照組比較物顯著性差異（ P） 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 創(chuàng)業(yè)計劃書 第四屆挑戰(zhàn)杯 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 商業(yè)計劃 第 26 頁 病理組織學(xué)檢查比較 大體標(biāo)本檢查未發(fā)生明顯病變 , 因此僅選正常對照組及高劑量組作組織病理學(xué)檢查。高劑量組大鼠的肝、腎、胃、脾、腸發(fā)片染色后光鏡檢查結(jié)果未見特異性病理改變 。 表 5 病理組織學(xué)檢查比較 ：從總體看 30d 喂養(yǎng)試驗化合物 C 對大鼠生長發(fā)育無不良影響 , 血常規(guī)、血清生化指標(biāo)均在正常值范圍內(nèi) , 病理學(xué)檢查未見特異性病變。表明無明顯毒性 , 為產(chǎn)品應(yīng)用的安全性 提供實驗依據(jù)。 藥效學(xué) 評價：化合物 C能有效降低小鼠 TC、 TG、 HDL、 LDL，并且降脂效果非常顯著，沒有發(fā)現(xiàn)任何的毒性作用，為高效低毒類藥物，非常有開發(fā)價值，根據(jù)《中藥非臨床安全性研究概論》要求，金銀花為藥食同源類中藥，安全性高，在金銀花中提取得到的化合物C 經(jīng)過動物毒理學(xué)實驗，沒有發(fā)現(xiàn)任何毒副作用，所以按照有關(guān)要求，臨床前研究只需要急性毒性實驗和長期毒性試驗數(shù)據(jù)。 2 劑量的選擇 小鼠實驗選擇劑量為 25mg/kg,折合人用量為 ,按照 70kg的人體重，每天服康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 創(chuàng)業(yè)計劃書 第四屆挑戰(zhàn)杯 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 商業(yè)計劃 第 27 頁 用 ，一天三次每次服用 ,(膠囊劑每次 2 粒，每粒含主藥 mg)，服用劑量合理，可以進行臨床實驗。 3 康脂素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草說明 金銀花原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) [名稱 ]金銀花。金銀花為忍冬科植物忍冬 Lonicera japonica Thunb.、紅腺忍冬 Lonicera hypoglauca Miq.、山銀花 Lonicera confusa Lonicera dasystyla Rehd.的干燥花蕾或帶初開的花。 :我國大部地區(qū)均產(chǎn)，而以山東產(chǎn)量最大，河南產(chǎn)的質(zhì)量較佳。 [性狀 ]忍科 呈棒狀，上粗下細(xì)， 略彎曲，長 2～ 3cm，上部直徑約 3mm，下部直徑約 。表面黃白色或綠白色，貯久色漸深，密被短柔毛。偶見葉狀苞片。花萼綠色，先端 5 裂，裂片有毛，長約 2mm。開放者花冠筒狀，先端二唇形；雄蕊 5 個，附于筒壁，黃色；雌蕊 1個，子房無毛。氣清香，味淡、微苦。 [鑒別 ]取本品粉末 ，加甲醇 5ml，放置 12 小時，濾過，濾液作為供試品溶液。另取化合物 C 對照品，加甲醇制成每 1ml含 1mg 的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（附錄Ⅵ B）試驗，吸取供試品溶液 10～ 20μ l，對照 品 溶液 10μ l，分別點于同一以 羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠 H 薄層板上，以醋酸丁酯－甲酸－水 （ 7::）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（ 365nm） 下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。 [檢查 ]按《中國藥典》（ 2021 年版一部附錄Ⅰ D）膠囊項下規(guī)定，對本品樣品進行了檢查，結(jié)果符合規(guī)定。 水分 照水分測定法（附錄Ⅸ H 第二法）測定，不得超過 % 總灰分 不得超過 %（附錄Ⅸ K） 。 酸不溶性灰分 不得超過 %（附錄Ⅸ K）。 重金屬以及有害元素 照 鉛、鎘、砷、汞、銅測定法（附錄Ⅸ B原子吸收分光光度法或附康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 創(chuàng)業(yè)計劃書 第四屆挑戰(zhàn)杯 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 商業(yè)計劃 第 28 頁 錄Ⅸ D 電感耦合等離子體質(zhì)譜法）測定，鉛、鎘、砷、汞、銅分別不能超過千分之五、千分之三、千分之二、千分之二、百萬分之二十。 [含量測定 ]照高效液相色譜法（附錄Ⅵ D）測定 。 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 : 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈 ％磷酸溶液（ 13： 87）為流動相；檢測波長為 327nm。理論板數(shù)按 C 峰計算不低于 1000。 對照品溶液的制備 : 精密稱取 C對照品適量，置棕色量瓶中，加 50％甲醇制成每 1ml 含 4μ g 的溶液，即得（ 10℃以下保存 ）。 供試品溶液的制備 : 取本品粉末約 ，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加 50％甲醇 50ml，稱定重量，超聲處理 30 分鐘，放冷，再稱定重量，用 50％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液 5ml，置 25ml 棕色量瓶中，加 50％甲醇至刻度，搖勻，即得。 測定法 : 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各 5～ 10μ l，注入液相色譜儀，測定，即得。 本品含 C（ C16H18O9）不得少于 ％。 [原料藥材 ]金銀花：上述鑒別方法是采用薄層色譜法，將原料藥材與金銀花對照藥材進行展開，顯色對比。若斑點顏 色相同，展開位置相同，則原料藥材合格。 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1 名稱、漢語拼音 康脂素 KANG ZHI SU 本品主要成分是金銀花提取分離化合物，有調(diào)血脂之功效。提取得到化合物 C 具有降血脂作用，是本品的主藥，根據(jù)其英文名 Kang lipid，譯為康脂素。 2 制法 ： 金銀花的提取分離工藝見下述產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)部分 儀器、試劑與試藥 紫外分光光度計；型號 :TU— 1800S；北京普析通用儀器公司電子分析天平型號 :AE240（梅特勒 — 托利多集團）； C 對照品（河南大學(xué)天然藥物化學(xué)研究所提供） 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 創(chuàng)業(yè)計劃書 第四屆挑戰(zhàn)杯 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 商業(yè)計劃 第 29 頁 煎煮條件篩選 金銀花采用水煎煮、濃縮的生產(chǎn)工藝 ,我們對此煎煮條件進行篩選。 二因素和水平選擇 藥材采用水煎煮 ,工藝中主要影響因素為煎煮次數(shù)、煎煮時間、加水量 ,根據(jù)中藥生產(chǎn)的常規(guī)方法 ,其一般煎煮次數(shù)為 1～ 3 次 ,即 1 次、 2 次、 3 次 ,煎煮時間為 小時、 1小時、 2小時 ,加醇量為 20%、 40%、 60%。按照統(tǒng)計學(xué)中正交試驗方法 ,我們采用 L3 的正交試驗設(shè)計方案進行試驗。 表 1 煎煮工藝因素水平 水平 A B C D 煮 次數(shù) (次 ) 煎煮時間 (小時 ) 加水量 空項 1 1 20 倍 2 2 1 40 倍 3 3 2 60 倍 :金銀花主要有效成分為總黃酮 ,總黃酮的測定以化合物 C為指標(biāo) ,測定煎煮濃縮后清膏的含量 ,以考察藥物中有效成分 C的提取率。 化合物 C的測定 (依照上述含量測定 ) 表 2 煎煮工藝正交試驗結(jié)果 編 因 素 評價指標(biāo) 號 A B C D 化合物 C 含量 煎煮次數(shù) 煎煮時間 加水量 空白項 (mg/g) 1 1 1 20 1 2 1 2 40 2 3 1 3 60 3 4 2 1 20 3 5 2 2 60 1 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 創(chuàng)業(yè)計劃書 第四屆挑戰(zhàn)杯 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 商業(yè)計劃 第 30 頁 6 2 3 40 2 7 3 1 60 2 8 3 2 40 3 9 3 3 20 1 K1 乙醇 K2 醇浸 K3 出物 R 得率 SS 3 煎煮液工藝方差分析。 將正交試驗結(jié)果進行方差分析 ,結(jié)果見表 3 表 3 煎煮工藝正丁醇浸出物方差 分析 方差來源 SS f S F P A 2 P B 2 P C 2 P 誤差 D 2 (2,2)=(2,2)= ,A因素中 K2K3K1,故此選擇煎煮次數(shù)為二次 ,B 因素中 K2K1K3,故此選擇煎煮時間為 1 小時 ,C 因素中 K1K3K2,從極性 R值大小顯示看 ,A因素影響最大 ,C因素次之 ,B因素影響最小 。從方差結(jié)果來看 ,A因素康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 創(chuàng)業(yè)計劃書 第四屆挑戰(zhàn)杯 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 商業(yè)計劃 第 31 頁 有顯著性差異 ,煎煮次數(shù)為二次 ,B、 C二個因素均無顯著性差異 ,即煎煮時間影響不大 ,但為盡量提出有效物質(zhì) ,煎煮時間設(shè)為 1 小時 。加醇量的多少與有效成分的提取多少無大的差別 。而且在大生產(chǎn)時加水量過大 ,既費時費力又浪費資源 ,故此加醇量選擇 20%。最后確定優(yōu)化條件為 A2B2C1即煎煮次數(shù)為 2次 。 煎煮時間每次為 1 小時 ， 加醇量為 20%倍量。 優(yōu)化后提取工藝驗證結(jié)果 分別稱取藥材 ,按上述工藝進行醇提取 ,濃縮 ,干燥 ,并分別測定干膏得率，共進行三次實驗 ,結(jié)果見下表 表 4 提取工藝驗證結(jié)果 次 數(shù) 1 2 3 平均 總的投藥量 (g) 1000 1000 1000 1000 干膏得率 % 化合物 C 含量 mg/g 通過本次采用正交試驗的研究 ,可以為以后的實際生產(chǎn)操作提供依據(jù)。 3 產(chǎn)品的制備見下述產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)部分 成品性狀 本品為膠囊劑，味微苦、澀。 鑒別 本品為黃酮類化合物，遇濃硫酸有熒光顯示。 按《中國藥典》（ 2021 年版一部附錄Ⅰ D）膠囊項下規(guī)定，對本品樣品進行了檢查，結(jié)果符合規(guī)定。 對金銀花中含有效成份化合物 C（黃酮類）的含量測定。 儀器與試藥 儀器 WATERS 2695 高效液相色譜儀 , WATERS322996 二極管陣列檢測器 ,MILLENNIUM 化學(xué)工作站 。 島津 LC210AT系列高效液相色譜儀 ,SPD210A紫外檢測器 ， CLASS2LC10色譜工作站 。 Met2tler AE163 電子天平 ,Sartorius BP2221S 電子天平。超聲提取器 (CQ2250 ,天津 ) 。 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 創(chuàng)業(yè)計劃書 第四屆挑戰(zhàn)杯 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 商業(yè)計劃 第 32 頁 試藥 化合物 C 對照品 (河南大學(xué)天然藥物化學(xué)研究所 ,供含量測定用 )， 乙腈為色譜純 ,其余試劑為分析純 。硅膠 G60 薄 層板 (E. MER2CK) 。 方法 鑒別 取膠囊一粒，研磨粉碎，加甲醇 5ml，放置 12 小時，濾過，濾液作為供試品溶液。另取化合物 C對照品，加甲醇制成每 1ml 含 1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（附錄Ⅵ B）試驗，吸取供試品溶液 10～ 20μ l，對照品溶液 10μ l，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠 H 薄層板上，以醋酸丁酯－甲酸－水（ 7::）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（ 365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上， 顯相同顏色的熒光斑點。 含量測定 對照品的制備 精密稱取對照品適量 ,置棕色瓶中 ,加 50 %甲醇使溶解 ,搖勻 ,制成每 1mL 含 g 的溶液 ,即得。 供試品溶液的制備 取膠囊一粒研細(xì) ,精密稱取約 ,置 50mL 量瓶中 ,加 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 創(chuàng)業(yè)計劃書 第四屆挑戰(zhàn)杯 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 商業(yè)計劃 第 33 頁 50 %甲醇適量 ,超聲 30min 使溶解 ,放至室溫 ,定容 ,搖勻 ,濾過 ( m) ,即得。 色譜條件 色譜柱 :DIKMA Diamonsil C18 (250mm 179。 ,5μ m) 。流動相 :乙腈 20. 4 %磷酸 (18∶ 82) 。流速 :178。 min 。柱溫 :35176。 C。檢測波長 :327nm。理論塔板數(shù)按化合物 C 峰計算應(yīng)不低于 2021。 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品溶液 5 ,10 ,20 ,25 ,30μ L ,按上述色譜條件進樣測定 ,以峰面積積分值 Y 為縱坐標(biāo) ,對照品量 X(μ g)為橫坐標(biāo) ,作線性回歸 ,得回歸方程 Y = 16789. 186 + 2966111. 589X , r = ,結(jié)果表明 C在 ～ g 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。 精密度試驗 精密吸取對照品溶液 20μ L,重復(fù)進樣 5次 ,按上述色譜條件測定 ,綠原酸峰面積積分值的平均值為 ,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD=%。 取同一批號樣品 (030605)5份 ,分別按樣品測定法測定。結(jié)果 :綠原酸平均含量為 g,RSD=%。 取金銀花的陰性對照顆粒 ,按供試品溶液制備方法制備 ,進樣 ,測定。圖譜表明陰性對照無干擾 ,見圖 2 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 創(chuàng)業(yè)計劃書 第四屆挑戰(zhàn)杯 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 商業(yè)計劃 第 34 頁 A B C 圖 2： 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液 ,每隔 1h 進樣 1 次 (20μ L),共進樣 6 次 ,按上述色譜條件分別測定 ,峰面積積分值 RSD=%,表明供試品溶液在 6h 內(nèi)基本穩(wěn)定。 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品 ,精密稱定 ,精密加入一定量綠原酸對照品 ,按供試品溶液制備項下方法制備 ,