20xx年醫(yī)學(xué)專題—木瓜蛋白酶的提取-資料下載頁(yè)
2024-11-19 04:46本頁(yè)面
【正文】 硝基苯胺鹽酸鹽2）儀器：溫控?fù)u床，恒溫混勻儀，電熱恒溫水槽，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，實(shí)驗(yàn)室Ph計(jì)，分析天平，電子天平，高速冷凍離心機(jī)，蛋白電泳系統(tǒng)，恒溫磁力攪拌器，真空冷凍干燥機(jī)，預(yù)裝柱HiTrap SPFF(1ML)，快速蛋白純化系統(tǒng)3）實(shí)驗(yàn)方法：（1）、粗酶溶液配制：稱取45g噴霧干燥的木瓜粗酶粉,在4℃下溶于半膚氨酸溶液（20Mm Cys，1Mm EDTA, PH ）中。待樣品充分溶解后,將溶液離心(20,000g,4℃，15minj)，收集上清。將該上清（大約45mg/ml）稀釋成不同的蛋白濃度,作為初始粗酶溶液待用。（2）、雙水相體系配制：按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)稱取相應(yīng)量的PEG（4000或6000）,鹽溶液（40%w/w磷酸鹽或40%w/w硫酸銨）和4g酶溶夜，置于15ml刻度離心管中,補(bǔ)加去離子水至總體系質(zhì)量為10g。其中,不同ph值的磷酸鹽溶液由40%（w/w）K2HPO4和40%（w/w）NaH2PO4配制而得。不同PH值的酶溶液由6M HCL 或NaOH調(diào)整而得。將配制好的雙水相體系放入4℃或20℃搖床中充分混合2h。將混合均勻的離心管在各自溫度下離心(10,000g，15min), ,以使兩相充分分離。讀取上、下相體積。用注射器分別吸取一定量的上、下相,進(jìn)行蛋白濃度和酶活測(cè)定。同時(shí),將樣品進(jìn)行堿性蛋白非變性電泳和快速蛋白液相色譜（FPLC）檢測(cè),以驗(yàn)證雙水相體系對(duì)木瓜蛋白酶的提純效果.(3)、上相中木瓜蛋白酶與成相聚合物PEG的分離：經(jīng)雙水相體系分離后,木瓜蛋白酶被萃取到富含PEG的上相,因此要將木瓜蛋白酶同成相聚合物PEG分離。本實(shí)驗(yàn)采用離子交換法將木瓜蛋白酶同PEG分開(kāi)。離子交換填料采用Sepharose SP Fast Flow 20 ml（柱子型號(hào)Amersham Biosciences XK 16,內(nèi)徑16mm）。離子交換柱平衡緩沖液為A: 50 Mm NaAC PH ，,洗脫緩沖液為B：50mM NaAC,1mM NaCL ph 。 mg/ml。用A 液平衡離子交換柱后,將稀釋液通入50ml,待流穿物完全流過(guò)柱子后,用23%的B液洗脫,收集洗脫峰。木瓜蛋白酶在填料S SP 。將收集的洗脫峰溶液放入透析袋中）（截留分子量3500Da）,4℃在4L去離子水中充分透析24h,期間更換3次水,收集透析液,以待凍干。（4）、木瓜蛋白酶的冷凍干燥時(shí)間測(cè)定：取25ml透析液分別放入8個(gè)干燥的無(wú)蓋培養(yǎng)皿中,在分析天平上準(zhǔn)確稱量各自的質(zhì)量,并記錄。再將各培養(yǎng)皿加上蓋子水平放入一40℃冰箱,冷凍10h。將冷凍后的培養(yǎng)皿去蓋,用保鮮膜包裹并在保鮮膜上均勻扎上小洞,放入真空冷凍干燥機(jī),凍干。按一定時(shí)間間隔依次取出培養(yǎng)皿,稱量所剩質(zhì)量。原始質(zhì)量與所剩質(zhì)量之差即為凍干過(guò)程中的失水量。將培養(yǎng)皿中的殘留物復(fù)溶于去離子水中,并重新定容為25ml,測(cè)定酶活。實(shí)驗(yàn)四：再用實(shí)驗(yàn)二的方法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量 ，通過(guò)比較分析提純的效果，再通過(guò)SDSPAGE檢測(cè)提純后是否有目的蛋白，并大致估算蛋白的含量。方法及原理：實(shí)驗(yàn)五：木瓜蛋白酶的活力測(cè)定 方法二：實(shí)驗(yàn)原理：木瓜蛋白酶可以水解N苯甲酰DL精氨酸對(duì)硝基苯胺鹽酸鹽（DLBAPNA）中的酞胺鍵釋放對(duì)硝基苯胺。而對(duì)硝基苯胺溶液為黃色,在410nm處有一個(gè)吸收峰,可以通過(guò)比色法測(cè)定對(duì)硝基苯胺的生成量,從而確定酶活大。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：試劑配制：（1）、底物存儲(chǔ)液：10mM DLBAPNA的DMSO溶液（2）、酶活緩沖液：檸檬酸一硼酸一磷酸各100mM , DTT,1mM EDTA,ph 。（3）、酶活終止液：50%（v/v）乙酸。樣品酶活測(cè)定：（1）、在具塞試管中加入xml待測(cè)酶溶液和（）ml酶活緩沖液,在37℃下孵育15min；（2）、將孵育好的試管放入恒溫振蕩反應(yīng)器,800rpm，開(kāi)始反應(yīng)；（3）、15min后,終止反應(yīng)；（4）、在410nm下測(cè)定吸光值,摩爾吸光系數(shù)8800M`—1cm—1。每個(gè)樣本做三次平行。內(nèi)容總結(jié)（1）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，，說(shuō)明超濾后木瓜蛋白酶的純度有所增加（2）用于調(diào)味品生產(chǎn)：
啤酒酵母菌是啤酒工業(yè)的一個(gè)附產(chǎn)物，通過(guò)木瓜蛋白酶分解而提取香味濃郁的酵母抽提物，經(jīng)調(diào)味后可制得酵母調(diào)味醬，它作為一種優(yōu)良的調(diào)味品提高了酵母菌的價(jià)值和利用率
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