20xx年醫(yī)學(xué)專題—膜蛋白的提取與分離-資料下載頁
2024-11-17 22:28本頁面
【正文】 淀部分再加入上次勻漿的上清液。4．合并3次上清液，2kg離心10min，棄上清，沉淀部分溶于100μl介質(zhì)，離心10min，棄上清，留沉淀。5．將沉淀部分加入70%蔗糖15份，然后分別置于三個離心管中，上面依次疊加54%、49%、45%，41%，37%蔗糖溶液各3份。6．700kg離心90min，～。7．～，洗滌2次。8．，用于細(xì)胞膜的研究分析8）常用的制備粗制質(zhì)膜組分的方法：（所有操作都在4攝氏度下進(jìn)行），倒出血水。用勻漿緩沖液漂洗組織碎塊，并將它們置于冰上，重復(fù)上述操作，直至組織碎成1mm3大小的碎片，且無可見的血。（體積比）與組織塊體積的緩沖液，再置于冰浴的Dounce氏玻璃勻漿器中，抽研1020次，勻漿組織。，上清含細(xì)胞膜、線粒體和細(xì)胞溶膠。沉淀中有未破碎的細(xì)胞及細(xì)胞核。棄沉淀。，沉淀線粒體。棄沉淀。，棄上清。，繼續(xù)勻漿，再次4攝氏度，10000g離心20min，棄上清。，保存于80攝氏度。9）用特殊的去污劑選擇性的分離。簡單，可靠，但有時含有其他蛋白。原理：4度時所有的蛋白質(zhì)原則上都溶于TritonX114水溶液，但在37度時，此溶液分為水相和去污相；此時親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中。方案放射性標(biāo)記受試細(xì)胞將標(biāo)記的細(xì)胞放在冰上去除上清，用pH7。4的冷磷酸鹽緩沖液洗滌單層細(xì)胞兩次加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min刮下單層細(xì)胞，4度下10 000g 5min離心溶液37度水浴10min以分離水相和去污劑相，然后37度下2 000g離心5min收集水相留作分析用500ul冰冷的buffer C溶解去污劑相沉淀，冰浴2min后加溫，在按步驟6再次離心按步驟8再次抽提去污劑相，用buffer C將洗滌后的去污劑相稀釋到初始體積用等量的buffer A分別稀釋水相與去污相，并進(jìn)行免疫沉淀實驗試劑：1）2%tritonX114:2%TritonX1150mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制劑2）緩沖液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer）3）buffer C10mmol/L Tris HCl()150mmol/L NaCl5mmol/L EDTA()10）植物中：高度純化的質(zhì)膜是質(zhì)膜蛋白研究的基礎(chǔ)，制備純化方法也很多，植物材料中以1蔗糖密度梯度離心、2水溶性雙水相法、3自由流電泳等方法為主。前兩種常用。1的產(chǎn)率較高但純度不高，2是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種分離高純度質(zhì)膜的方法，經(jīng)多次雙水相分配即可得到高純度質(zhì)膜，近些年此方法廣泛用于植物質(zhì)膜的純化。內(nèi)容總結(jié)
（1）膜蛋白的提取與分離
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