【正文】 99%以上，其主要限制來自同聚物，也就是相同堿基的連續(xù)摻入 ，如 AAA或 GGG。由于沒有終止元件來阻止單個(gè)循環(huán)的連續(xù)摻入，同聚物的長(zhǎng)度就需要從信號(hào)的強(qiáng)度中推斷出來。這個(gè)過程可能產(chǎn)生誤差。因此， 454FLX測(cè)序的主要錯(cuò)誤類型是插入 /缺失，而不是替換。 （知道）第七十三 頁 ，共九十一 頁 。第二代測(cè)序技術(shù)： Solexa測(cè)序技術(shù)原理：將待測(cè) DNA打斷 成約 100～ 200bp大小，在片段兩端接上 接頭 。將 DNA片段變成單鏈后通過接頭與芯片表面的引物堿基互補(bǔ)而使一端被固定在芯片上，另外一端隨機(jī)和附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被固定住，形成 橋狀結(jié)構(gòu) 。通過 擴(kuò)增 ，形成單克隆的 DNA簇，隨后將 DNA簇線性化。在下一步合成反應(yīng)中，加入改造過的 DNA聚合酶和帶有 4種熒光標(biāo)記 的 dNTP（對(duì)硫磷）。在 DNA合成時(shí)，每一個(gè)核苷酸加到引物末端時(shí)都會(huì)釋放焦磷酸鹽，激發(fā)生物發(fā)光蛋白發(fā)出熒光。用激光掃描反應(yīng)板表面，在讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類后，將這些熒光集團(tuán) (j237。tu225。n)化學(xué)切割，恢復(fù) 3`端黏性，隨后添加第二個(gè)核苷酸。如此重復(fù)，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，就可以得知每個(gè)模板 DNA片段的序列。 (知道 )第七十四 頁 ，共九十一 頁 。測(cè)序步驟：測(cè)序文庫 (w233。nk249。)的構(gòu) 建錨定 橋接預(yù)擴(kuò) 增單堿基 延伸測(cè)序數(shù)據(jù)分 析第七十五 頁 ，共九十一 頁 。添加接頭 (jiēt243。u)：利用物理方法將待測(cè)樣品 DNA打碎，在單鏈DNA碎片兩端加上接頭 (jiēt243。u)。第七十六 頁 ，共九十一 頁 。表面結(jié)合：Solexa的測(cè)序時(shí)利用微注射系統(tǒng)將已經(jīng) (yǐjing)加過接頭和待測(cè)片段隨機(jī)添加到玻璃FlowCell內(nèi)，每一個(gè) FlowCell又被分成 8條 Lane，每條Lane的內(nèi)表面上能以共價(jià)鍵的形式隨機(jī)固定單鏈接頭序列和帶接頭的單鏈待測(cè) DNA片段。第七十七 頁 ，共九十一 頁 。所有單鏈橋型待測(cè)片段擴(kuò)增成雙鏈橋片段，通過變性，釋放出互補(bǔ)的單鏈，錨定(m225。o d236。nɡ)到附近的固相表面。通過不斷循環(huán)，將會(huì)在Flow Cell的固相表面上獲得上萬條成簇分布的雙鏈待測(cè)片段。第七十八 頁 ，共九十一 頁 。加入DNA聚合酶和被熒光標(biāo)記的dNTP和接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增，在每一個(gè)測(cè)序簇延伸互補(bǔ)鏈時(shí)，每加入一個(gè)被熒光標(biāo)記的dNTP就能釋放出相應(yīng)的熒光，測(cè)序儀通過捕獲熒光信號(hào)，并通過計(jì)算機(jī)將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為測(cè)序峰，從而(c243。ng 233。r)獲得待測(cè)片段的序列信息。第七十九 頁 ，共九十一 頁 。Solexa技術(shù)特點(diǎn)：技術(shù)優(yōu)勢(shì) (yōush236。)：測(cè)序性價(jià)比最高，運(yùn)行成本低；可擴(kuò)展的高通量；需要樣品量少；簡(jiǎn)單、快速、自動(dòng)化誤差來源：每次添加核苷酸之前對(duì)熒光信號(hào)的切割，如果切割不完全，產(chǎn)生誤差。 （知道）第八十 頁 ，共九十一 頁 。、第三代測(cè)序技術(shù) (j236。sh249。)： Heliscope單分子測(cè)序儀原理： 將基因組 DNA切割成隨機(jī)的小片段 DNA分子并且在每個(gè)片段末端加上 polyA（ 多聚腺嘌呤核糖核苷酸 ）尾巴。通過 polyA和固定在芯片上的 polyT雜交，將待測(cè)模板固定到芯片上，制成測(cè)序芯片。最后借助聚合酶將熒光標(biāo)記的單核苷酸摻入到引物上，采集熒光信號(hào)。之后切除熒光標(biāo)記基團(tuán)，進(jìn)行下一輪測(cè)序反應(yīng)，如此反復(fù)，最終獲得完整的序列信息 。 （知道）第八十一 頁 ，共九十一 頁 。步驟：隨即打碎待測(cè)片段， 3’末端加上 Poly（ A）末端轉(zhuǎn)移酶在接頭末端加上 Cy3熒光 (y237。ngguāng)標(biāo)記用小片段與表面帶有寡聚 Poly（ T）的平板雜交加入 DNA聚合酶和 Cy5熒光標(biāo)記的 dNTP（對(duì)硫磷）進(jìn)行 DNA合成反應(yīng)，每一輪反應(yīng)加入一種 dNTP。洗脫未參與合成的 dNTP和 DNA聚合酶，檢測(cè)雜交位置的熒光信號(hào)化學(xué)試劑去熒光標(biāo)記重復(fù)合成、洗脫、成像、猝滅過程，完成測(cè)試。 （知道）第八十二 頁 ，共九十一 頁 。HeliScope的優(yōu)勢(shì)：?jiǎn)畏肿?(fēnzǐ)測(cè)序減少了試劑的使用，測(cè)序成本價(jià)格大大降低。不需要擴(kuò)增建立 DNA庫，從而減少誤差。第八十三 頁 ，共九十一 頁 。、第三代測(cè)序方法： SMRT法原理： SMRT芯片是一種帶有很多 ZMW(zeromode waveguides)孔的厚度為 100 nm的金屬片。將 DNA聚合酶、待測(cè)序列和不同熒光標(biāo)記的 dNTP放入 ZMW孔的底部，進(jìn)行合成反應(yīng) 。當(dāng)一個(gè) (yī ɡ232。)dNTP被添加到合成鏈上的同時(shí)，它會(huì)進(jìn)入 ZMW孔的熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)并在激光束的激發(fā)下發(fā)出熒光，根據(jù) 熒光的種類 就可以判定 dNTP的種類。在下一個(gè) dNTP被添加到合成鏈之前，這個(gè) dNTP的磷酸基團(tuán)會(huì)被氟聚合物（fluoropolymer）切割并釋放，熒光分子離開熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)。 （知道）第八十四 頁 ，共九十一 頁 。SMRT測(cè)序流程(lich233。ng)第八十五 頁 ，共九十一 頁 。SMRT測(cè)序的特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)：特點(diǎn)：邊測(cè)序變合成，熒光標(biāo)記的位置是磷酸基團(tuán)而不是堿基。優(yōu)勢(shì)： 速度很快，利用這種技術(shù)測(cè)序速度可以達(dá)到每秒 10個(gè) dNTP 。 信號(hào)強(qiáng)度大。由于 dNTP在熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)停留的時(shí)間（毫秒級(jí)）與它進(jìn)入和離開的時(shí)間（微秒級(jí)） 相比 (xiānɡ bǐ)會(huì)很長(zhǎng)，所以信號(hào)強(qiáng)度會(huì)很大。第八十六 頁 ，共九十一 頁 。第三代測(cè)序方法：納米孔單分子法OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的 納米孔單分子技術(shù) 是一種基于電信號(hào)測(cè)序 的技術(shù)。他們?cè)O(shè)計(jì)了一種以 α溶血素為材料制作的納米孔，在孔內(nèi)共價(jià)結(jié)合有分子接頭 環(huán)糊精 。用 核酸外切酶 切割 ssDNA（單鏈 DNA）時(shí)，被切下來的單個(gè)堿基會(huì)落入納米孔，并和納米孔內(nèi)的環(huán)糊精相互作用，短暫地影響流過納米孔的 電流強(qiáng)度 ，這種電流強(qiáng)度的變化幅度就成為每種堿基的特征。堿基在納米孔內(nèi)的平均停留時(shí)間是毫秒級(jí)的，它的解離速率常數(shù)與電壓有關(guān)， 180mV的電壓就能夠保證在電信號(hào)記錄后將堿基從納米孔中清除。而且納米孔單分子技術(shù)可直接讀取甲基化的胞嘧啶，而不像傳統(tǒng)方法那樣必須要用重亞硫酸鹽處理。該技術(shù)尚處于研發(fā)階段，目前面面臨的兩大問題 (w232。nt237。)是尋找合適的 外切酶載體 和承載納米孔平臺(tái)的材料。（了解）第八十七 頁 ，共九十一 頁 。納米 (n224。mǐ)孔單分子法示意圖 第八十八 頁 ，共九十一 頁 。納米孔單分子測(cè)序的特點(diǎn)：準(zhǔn)確度高，納米孔單分子技術(shù)準(zhǔn)確率能達(dá)到 %，且一旦發(fā)現(xiàn)替換錯(cuò)誤也能較容易 (r243。ngy236。)地更改。（因?yàn)?4種堿基中的 2種與另外 2種的電信號(hào)差異很明顯，因此只需在與檢測(cè)到的信號(hào)相符的 2種堿基中做出判斷，就可修正錯(cuò)誤。）另外由于每次只測(cè)定一個(gè)核苷酸因此該方法可以很容易地解決同聚物長(zhǎng)度的測(cè)量問題。不需要熒光標(biāo)記。面臨問題：尋找合適的外切酶載體以及承載納米孔平臺(tái)的材料 第八十九 頁 ，共九十一 頁 。謝謝觀 看第九十 頁 ，共九十一 頁 。內(nèi)容 (n232。ir243。ng)總結(jié)主要通 過檢測(cè) 什么 檢測(cè) 大 腸 桿菌：。?；撬崮?夠 使 細(xì) 胞聚集從而改善 檢測(cè) 靈敏度 ,將少量的?；撬崽砑拥?懸 浮液中。 2% RNase清除剖 (體 積 比 ):使用娃哈哈 純凈 水稀 釋RNase清除刻 ,用于芯片及 PCR耗材清 潔 。 末端 轉(zhuǎn) 移 酶 在接 頭 末端加上 Cy3熒 光 標(biāo)記 。優(yōu)勢(shì) ： 速度很快，利用 (l236。y242。ng)這 種技 術(shù)測(cè) 序速度可以達(dá)到每秒 10個(gè) dNTP。 謝謝觀 看第九十一 頁 ，共九十一 頁 。