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2024-09-20 20:45本頁面
【正文】 性，從而分離質(zhì)粒 DNA。 ? 三、實驗用具及試劑 高速離心機、微量移液器、槍頭、凝膠電泳系統(tǒng)，凝膠紫外成像系統(tǒng)， EP管 EB，加樣緩沖液，陽性克隆的培養(yǎng)液，質(zhì)粒提取試劑盒 ? 四、實驗操作 1. 取 1~4ml過夜培養(yǎng)的陽性克隆菌液， 12022rpm離心2min,棄上清 250ul的 solutionⅠ( 含 RNaseA1)充分懸浮細菌沉淀 250ul的 solutionⅡ 輕輕上下翻轉(zhuǎn)混合 5~6次使菌體充分裂解，形成透明溶液 400ul的 4 ℃ 預(yù)冷的 solutionⅢ ，輕輕上下翻轉(zhuǎn)混合 5~6次，直至形成緊實凝集塊，室溫靜置 2min ? 12022rpm， 10min，取上清 Spin column安置于 collection Tube上 6中的上清液轉(zhuǎn)移至 Spin column中 12022rpm， 1min，棄濾液 500ul的 RinseA加入 Spin column中， 12022rpm， 30s，棄濾液 700ul的 RinseB加入 Spin column中， 12022rpm， 30s，棄濾液 9 ? Spin column安置于新的 ,在 Spin column膜中央處加入 60ul滅菌或 Elution Buffer,室溫靜置 1min 12. 12022rpm， 1min洗脫 DNA ，并以空載體做對照，從質(zhì)粒大小上初步判斷是否有外源基因進入載體 ? 五、思考題 在堿法提取質(zhì)粒 DNA操作過程中應(yīng)該注意哪些問題？ ? 實驗八 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 ，重點掌握重組質(zhì)粒的酶切鑒定方法 一、實驗?zāi)康? ? 二、實驗原理 ：是一類能識別雙鏈 DNA分子特異性核酸序列的 DNA水解酶。是體外剪切基因片段的重要工具，所以常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。限制性核酸內(nèi)切酶不僅是 DNA重組中重要的工具，而且還可以用于基因組酶切圖譜的鑒定 ? 2. 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素 ?DNA的純度； ?DNA的甲基化程度； ?酶切消化反應(yīng)的溫度； ?DNA的分子結(jié)構(gòu)； ?溶液中離子濃度及種類； ?緩沖液的 pH值 。 ? 三、實驗用品及試劑 恒溫水浴鍋、微量加樣器、槍頭、凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng) 酶 Hind III 和 BamH I 核酸內(nèi)切酶（ Takara） ， Hind III和 BamH I酶解緩沖液 (10 通用 buffer)，瓊脂糖，pMD18T質(zhì)粒，加樣緩沖液 ? 四、實驗步驟 1. 對初步確定有外源基因進入的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶進行切割，進行進一步的鑒定 重組質(zhì)粒 DNA 10ul ddH2O 7ul 10 通用緩沖液 2ul BamH I（ 10U/ul） Hind III（ 10U/ul） 總體積 20ul 2. 37℃ 保溫 ，對酶切后的片段進行比對，從酶切后的片段的數(shù)目及大小上進行確認 五、思考題 ? 除了酶切鑒定重組質(zhì)粒外，還可以選用何種方法鑒定？
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