【正文】 A擴(kuò)增檢測(cè)。 PCR結(jié)果異常分析（1）非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物不止一種時(shí)，通常與以下幾種情況有關(guān)：A. 背景DNA與引物同源性高?？赏ㄟ^在兩個(gè)引物的內(nèi)側(cè)序列上再使用另外一對(duì)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物DNA再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增。B. 退火溫度太低。引物和模板的配對(duì)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，分子的熱運(yùn)動(dòng)使引物與模板結(jié)合與解離而達(dá)到最佳配對(duì)位點(diǎn)上。退火溫度太低，造成引物與模板的非特異性位點(diǎn)部分配對(duì)而解離不下來，這種不正確的配對(duì)，進(jìn)入PCR反應(yīng)過程就可擴(kuò)增出非特異性的產(chǎn)物DNA。提高退火的溫度將可改善結(jié)果。C. 過量的酶、引物和模板DNA可使PCR反應(yīng)造成混亂，強(qiáng)行擴(kuò)增出非特異性產(chǎn)物DNA，適當(dāng)降低這些試劑的量有助于問題的解決。（2）無特異性擴(kuò)增產(chǎn)物帶A. 引物溶液反復(fù)凍融或污染了DNA酶類，造成引物降解。B. 模板DNA制備時(shí)模板已降解。C. Taq酶有失活或有雜酶污染。D. 緩沖液條件不當(dāng)。E. 引物不正確。 試劑與器材1. 試劑 （1）模板DNA 沸水浴制備的大腸桿菌染色體DNA （2）Taq DNA聚合酶 （3）10緩沖液 （4）dNTP（） （5）Primer1（10pmol/ml） （6）Primer2（10pmol/ml）2. 器材 （1）eppendorf管 PCR專用薄壁管（200ml） （2）槍頭 進(jìn)口（潔凈度高） （3）移液器 （4）離心機(jī) PCR發(fā)應(yīng)液混合后離心 （5）PCR儀 （6）超凈工作臺(tái) 提供潔凈操作區(qū)用于PCR加樣（1）按如下體積加樣進(jìn)行PCR反應(yīng)： 1 2 總體積 50ml 50ml ddH2O 10buffer（含Mg2+） 5ml 5ml dNTP（） 4ml 4ml Primer1（10pmol/ml） 5ml 5ml Primer2（10pmol/ml） 5ml 5ml 染色體DNA（沸水浴制備） 2ml 4ml Taq酶（5U/ml） （2）充分混勻后按下列條件進(jìn)行反應(yīng)： 97℃ 5min 95℃ 30s 57℃ 1min 30個(gè)循環(huán) 72℃ 2min 72℃ 10min 4℃ ∞（3）取40ml采用瓊脂糖凝膠電泳檢查產(chǎn)物情況， kb片段的位置附近，割下該位置的凝膠進(jìn)行外源DNA的回收。6 目的基因片段的回收摘要 本單元主要介紹凝膠電泳中DNA片段回收的各種方法及優(yōu)缺點(diǎn)，要求學(xué)會(huì)根據(jù)不同回收對(duì)象選擇不同的回收方法。DNA片段的分離與回收是基因工程操作中一項(xiàng)重要的技術(shù)，如可收集特定酶切片段用于基因克隆或是制備探針，回收PCR產(chǎn)物用于再次鑒定等。理想的DNA片段回收方法應(yīng)滿足以下幾個(gè)要求：（1）回收片段應(yīng)有非常高的純度如從普通凝膠中分離出來的片段不可帶有即使是微量的凝膠――凝膠會(huì)抑制大部分的酶活力，對(duì)于后續(xù)DNA片段用于再酶切分析或連接均是不利的。（2）回收過程必須是嚴(yán)格的無DNA酶污染的操作過程衡量的Dnase均可能使回收的目的DNA片段降解，當(dāng)降解作用僅發(fā)生在粘性末端時(shí)，在凝膠電泳中是無法看到回收的DNA片段有任何差異，但會(huì)導(dǎo)致DNA連接實(shí)驗(yàn)的失敗，最終影響后續(xù)的克隆實(shí)驗(yàn)。（3）能回收不同大小的DNA片段對(duì)于采用的回收方法必須能對(duì)不同大小的DNA片段均能回收，當(dāng)回收大片段時(shí)不發(fā)生機(jī)械性損傷與斷裂作用，造成大片段斷裂。（4）回收效率要高回收方法要能對(duì)微量DNA也能進(jìn)行操作，也即回收效率相對(duì)要較高，則對(duì)于實(shí)驗(yàn)中獲得的非常微量的DNA樣品也可進(jìn)行分析。（5）操作簡(jiǎn)單、快速在回收過程中一般不需特殊的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，也不需要昂貴的試劑，并且操作時(shí)間較短，象現(xiàn)在常用的試劑盒回收在電泳完成后整個(gè)回收過程只需30min左右，并且樣品的回收率可達(dá)50％。由于分離方法眾多，且各種不同的方法可能同時(shí)依據(jù)多項(xiàng)原理，所以只能粗略地將各種方法分成五大類：電泳法、收集孔法、機(jī)械破碎法、溶（熔）膠法與酶處理法：一、電泳法根據(jù)凝膠割否分透析袋法與流動(dòng)電洗脫法（割膠），濾紙透析膜法與DEAE膜法（不割膠）。（1）透析袋法該方法可回收大于5kb的片段，缺點(diǎn)是操作麻煩并易造成DNA酶的污染。（2）流動(dòng)電洗脫法該方法回收片段大小為4～50kb，且回收效率高達(dá)94～100％，極端條件下可回收大至550kb的片段。缺點(diǎn)是操作繁瑣，而且為了取得較高的回收率，需特定的流動(dòng)電洗脫槽。（3）濾紙透析膜法回收率平均達(dá)70％左右，不需割膠，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但實(shí)驗(yàn)中需將濾紙上的DNA洗脫，也較繁瑣，也不易控制。（4）濾紙透析膜法此方法用于回收小片段，一般小于5kb的片段回收效率較高，可達(dá)70％以上；對(duì)于大片段（15kb）則難以從DEAE膜上洗脫下。二、收集孔法（1）蔗糖法回收小片段效率較高，%，并且回收中能將較寬的條帶濃縮于收集孔中，但回收中制作收集孔較麻煩，并且收集孔中要加入蔗糖，故獲得的DNA樣品不能直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（2）羥基磷灰石法該方法回收效率也較高，不利之處與上述方法相同，獲得的DNA需再純化，操作也較繁瑣。三、機(jī)械破碎法指用機(jī)械力將凝膠壓碎后再行回收DNA片段，有凍擠法，凍融法、壓碎浸泡法、（單層）濾膜過濾法及雙層（親和）膜過濾法。（1）凍擠法將膠條割下置于塞有玻璃棉的吸嘴或是管底刺有小孔的eppendorf管中，冰凍30min后全速離心5min，收集清液，再經(jīng)酚抽提、乙醇沉淀等純化濃縮處理（也可直接沉淀）。其基本原理理是利用離心力將凝膠中原有的液體擠出，同時(shí)也帶出膠中的DNA。從膠濃度為1%瓊脂糖中回收650bp、回收率分別為90％、74％、56％、30％。這是因?yàn)榇蠓肿覦NA更難于被膠中的緩沖液帶出，所以此法只適用于回收較小的DNA片段。（2）凍融法割下的膠條放在eppendorf管中，將之搗碎并放于80℃冰凍5min，取出后迅速放置于37℃保溫10min，如此反復(fù)3次能使DNA從膠中游離出來，離心獲得上清中即含有目的DNA，可通過沉淀濃縮獲得高濃度。對(duì)一般的DNA片段回收效率在60～80%。操作簡(jiǎn)單，并不需特殊設(shè)備。（3）壓碎浸泡法又稱醋酸銨法，操作較費(fèi)時(shí)，回收效率較低，一般改良的方法是在凍擠法操作中，加入一定的水并浸泡10min，增加DNA的回收率。四、溶膠法根據(jù)物理或化學(xué)溶膠可分為低融點(diǎn)法（物理熔膠）與NaI、KI、NaClO4溶膠法（化學(xué)溶膠）。（1）低融點(diǎn)膠法采用特殊的低融點(diǎn)凝膠，該膠在65℃即溶化，實(shí)驗(yàn)中是先灌制正常的凝膠，然后用低融點(diǎn)膠取代其中的部分（即可節(jié)約低融點(diǎn)凝膠用量，也能保證電泳中整塊凝膠的完整性。）電泳完成后割下的凝膠可于65℃下保溫溶解，后直接用于酶切，連接，DNA標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)。操作方便簡(jiǎn)單，但需特殊的低融點(diǎn)凝膠，成本較高，且回收得到的樣品濃度較低。（2）化學(xué)融膠法瓊脂糖能溶解于一些鹽溶液中（NaI、KI、NaClO4），然后可用特殊的純化柱將DNA樣品溶液純化，現(xiàn)在廣泛使用的凝膠電泳中DNA片段回收試劑盒基本采用了此中回收原理，能在短時(shí)間內(nèi)獲得目的DNA片段，成本也較低。五、酶處理法對(duì)于大片段DNA的回收，象酵母人工染色體的克隆實(shí)驗(yàn)中，克隆片段可大到2 000kb，一般采用此方法。利用瓊脂糖酶降解瓊脂糖，能較溫和的裂解瓊脂糖，最終成功回收DNA片段。 DNA回收中的注意事項(xiàng)除了選擇合適的方法外，實(shí)驗(yàn)中還要注意以下幾點(diǎn)：（1）防止抽提過程中污染DNA酶與回收片段接觸的試劑與器皿等都應(yīng)進(jìn)行滅菌（酶）處理，即使是不能用干熱或濕熱法滅菌的器皿也要用乙醇浸泡以滅殺活菌與DNA酶，不然可能發(fā)生回收片段部分降解的現(xiàn)象，有時(shí)甚至一無所獲。即使是輕微的降解反應(yīng)——當(dāng)發(fā)生在粘性末端時(shí)也會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的連接困難。（2）紫外照射選擇長(zhǎng)波段回收過程往往需在紫外等監(jiān)測(cè)下進(jìn)行，與一般觀察電泳結(jié)果不同的是這時(shí)應(yīng)用長(zhǎng)波紫外燈。因?yàn)槎滩ㄗ贤饩€（254nm）會(huì)引起DNA的斷裂或是形成TT二聚體，前者會(huì)使以后的連接與轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)失敗，后者可能造成基因突變，給克隆工作帶來麻煩。即使是使用了長(zhǎng)波紫外照射，回收DNA時(shí)也要盡量短時(shí)照射，避免連續(xù)長(zhǎng)時(shí)間照射。（3）實(shí)驗(yàn)操作要輕柔特別在處理較大片段時(shí)應(yīng)防止機(jī)械剪切作用DNA對(duì)的破壞，如吸取液體、轉(zhuǎn)動(dòng)離心管等操作均應(yīng)緩慢、輕柔。綜上所述，只有在合適的回收方法基礎(chǔ)上注意具體操作步驟是才能有效回收所需片段，為以后的酶切、連接、標(biāo)記等工作打下良好基礎(chǔ)。 試劑與器材1. 試劑 （1）瓊脂糖 （2）TAE緩沖液 （3）溴化乙錠（1mg/ml） （4）無水乙醇 （5）70％乙醇 （6）KAc（pH=，3M） （7）回收試劑盒 （8）無菌ddH2O2. 器材 （1）eppendorf管 （2）槍頭 （3）移液器 （4）電泳槽、電泳儀、電泳板和梳子 （5）微波爐 （6）紫外投射分析儀 （7）數(shù)碼相機(jī) （8）恒溫水浴 （9）冰箱 （10）針頭 試劑盒法（Kit回收法，以上海申能博彩生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒為例）（1）從電泳板上切割含目的DNA片段的凝膠塊（割膠盡可能的小，提供后續(xù)回收效率）（2），將其適當(dāng)切小，加速溶解。每100mg凝膠加入400μl solution SN。（若稱重省略，一般加入400μl SN）（3）凝膠溶解：5560℃，保溫510分鐘，每2分鐘混勻一下，使凝膠溶解，膠完全融化后每400μl solution SN中加入solution B 100μl，混勻。（4）將3S柱裝入2ml洗管，將上述混合液轉(zhuǎn)移至3S柱，室溫放置2min。室溫10 000 rpm離心1分鐘，穩(wěn)定45秒。（5）取下3S柱，倒掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一收集管中，加入600μl Wash Solution，室溫10 000 rpm離心1分鐘。（6）重復(fù)步驟5一次。（7）取下3S柱，倒掉收集管中廢液，將3S柱放入同一收集管中，室溫10 000 rpm離心2分鐘。（8）將3S柱放入新的離心管中，在3S柱子膜中央加30μl ddH2O，不加蓋室溫放置2分鐘。（9）蓋上離心管，室溫10 000 rpm離心1分鐘，離心管中的液體即為回收的DNA片段。 凍融、擠壓回收法（1）用手術(shù)刀在DNA紫外檢測(cè)儀下切割下含有所要DNA片段的凝膠塊置于Eppendorf管中，甩至管底，20℃凍存30min，（2）取出后用牙簽將凝膠塊盡量搗碎，剪去管上部，用燒紅的針頭在管底扎幾個(gè)微孔，孔徑越細(xì)越好。（3）將管套入另一個(gè)Eppendorf管中，常溫下，15 000rpm離心10分鐘。（4）將上清液吸到收集管中，向沉淀中加入100μl重蒸水。（5）重復(fù)步驟（2）、（3）、（4）兩遍（如圖所示）。（6）收集的上清于15 000rpm，4℃離心20分鐘，吸取上清液，補(bǔ)足400μl。（7） 的KAc（pH=，3M）～ 的無水乙醇，充分混勻后20℃放置30min，取出15 000rpm，4℃離心30min。（8）棄上清，加入400μl 70％的乙醇，15 000rpm，4℃離心5min。（9）棄上清并倒扣3~5min，然后37℃烘干（30min左右即可）。（10）烘干沉淀可用30ml ddH2O溶解，待用。7 核酸分子雜交摘要 本單元主要介紹各種分子雜交的基本原理與特點(diǎn)，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)介紹了一種常用的DNA轉(zhuǎn)移方法，要求掌握采用DIG分子雜交試劑盒進(jìn)行的大腸桿菌基因組Southern Blotting。核酸分子雜交是通過配對(duì)堿基對(duì)之間的非共價(jià)鍵（主要是氫鍵）結(jié)合，從而形成穩(wěn)定的雙鏈區(qū)。雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補(bǔ)，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補(bǔ)順序（即某種程度的同源性）就可以形成雜交雙鏈。分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進(jìn)行。由于DNA一般都以雙鏈形式存在，因此在進(jìn)行分子雜交時(shí)，應(yīng)先將雙鏈DNA分子解聚成為單鏈，這一過程稱為變性，一般通過加熱或提高pH值來實(shí)現(xiàn)。用分子雜交進(jìn)行定性或定量分析的最有效方法是將一種核酸單鏈用同位素或非同位素標(biāo)記成為探針，再與另一種核酸單鏈進(jìn)行分子雜交。隨著基因工程研究技術(shù)的迅猛發(fā)展，新的核酸分子雜交類型和方法在不斷涌現(xiàn)和完善。核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型：（1）固相雜交將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸游離在溶液中。固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。由于固相雜交后，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上留下的雜交物容易檢測(cè)和能防止靶DNA自我復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，所以最為常用。常用的固相雜交類型有：菌落原位雜交、斑點(diǎn)雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。（2）液相雜交所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中，一種研究最早且操作復(fù)合的雜交類型，在過去的30年里雖有時(shí)被應(yīng)用，但總不如固相雜交那樣普遍。主要缺點(diǎn)是雜交后過量的未雜交探針在溶液中除去較為困難和誤差較高。近幾年由于雜交檢測(cè)技術(shù)的不斷改進(jìn)，商業(yè)性基因探針診斷盒的實(shí)際應(yīng)用，推動(dòng)了液相雜交技術(shù)的迅速發(fā)展。 固相膜核酸分子雜交（1）菌落原位雜交（Colony in situ hybridization）將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA，再烘干固定DNA于膜上，與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)，并與平板上的菌落對(duì)位。（2）斑點(diǎn)雜交（Dot blotting）該方法是將被檢標(biāo)本點(diǎn)到膜上，烘烤固定。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析，一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。為使點(diǎn)樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀（manifolds），如Minifold I和II、BioDot（BioRad）和HybriDot，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會(huì)流到膜上呈斑點(diǎn)狀或狹縫狀，反復(fù)沖洗進(jìn)樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，這時(shí)的膜就可以進(jìn)行雜交。（3）So