【正文】 密碼或改變可讀框，即移碼突變。13．答 M13克隆系統(tǒng)具有很多優(yōu)點： (1)克隆的片段大：M13噬菌體的DNA在包裝時不受體積的限制，所以容載能力大，有報道，有些噬菌體顆?？梢园b比野生型絲狀噬菌體DNA長6—7倍的DNA(插人片段可達(dá)40kb)。 (2)可直接產(chǎn)生單鏈DNA，這對于DNA測序、DNA誘變、制備特異的單鏈DNA探針都是十分有用的。 (3)單鏈DNA和雙鏈DNA都可以轉(zhuǎn)染宿主，并可根據(jù)人工加上的選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選。 M13克隆系列的不足： (1)較大的外源片段插入后，在擴(kuò)增過程中往往不夠穩(wěn)定，一般說，克隆的片段越大，發(fā)生丟失的機(jī)率越大。 (2)單鏈載體分子感染的細(xì)胞中，往往是單鏈和雙鏈混雜，分離雙鏈比較麻煩。14．答： 主要特點有： (1)具有質(zhì)粒復(fù)制子，進(jìn)入寄主細(xì)胞后能夠像質(zhì)粒一樣進(jìn)行復(fù)制，并且能夠被氯霉素擴(kuò)增。 (2)具有質(zhì)粒載體的抗生素抗性基因的選擇標(biāo)記。 (3)具有l(wèi)噬菌體的包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。 (4)容載能力大?？寺〉淖畲笃卧?5kb，最小片段為19kb。 (5)簡化了篩選。如果載體的分子量在5kb的話，得到的轉(zhuǎn)導(dǎo)子幾乎排除由載體自連的可能性，因為要被成功包裝，至少要7個分子的載體自連，盡管如此，也是不能被包裝的，因為COS位點太多了。 黏粒載體也有如下不足：(1)如果兩個黏粒之間有同源序列，可能會發(fā)生重組，結(jié)果會使被克隆的片段重排或丟失。 (2)含不同重組DNA片段的菌落生長速度不同，會造成同一個子板上菌落大小不一。另外由于不同大小的插入片段對宿主細(xì)胞的作用不同，會造成文庫擴(kuò)增量的比例失調(diào)。 (3)包裝過程復(fù)雜，包裝效率不穩(wěn)定，代價高。 15．答： 雖然噬菌粒載體攜帶有M13的IG區(qū)，能夠合成單鏈DNA，但是它沒有M13的功能基因，沒有M13基因2的產(chǎn)物存在，所以不能合成單鏈DNA。而輔助噬菌體具有M13的所有功能基因，但是IG區(qū)是缺陷的，輔助噬菌體本身的DNA不能進(jìn)行單鏈復(fù)制，于是就可以為噬菌粒提供基因2產(chǎn)物和包裝蛋白。 輔助噬菌體必需具備如下條件： (1)助噬菌體的DNA IG區(qū)必需失去功能，其本身的DNA不會被包裝到成熟的噬菌體顆粒中； （2）由于輔助噬菌體的IG區(qū)失活，其本身的基因不能表達(dá)，要使輔助噬菌體的所有功能基因都能進(jìn)行表達(dá)，必須在輔助噬菌體的基因組中導(dǎo)人新的復(fù)制起點； (3)輔助噬菌體的基因組中具有選擇標(biāo)記，便于識別和收集一定數(shù)量的輔助噬菌體。16．答： 可以通過合成核苷酸探針或設(shè)計簡并PCR引物從cDNA文庫或基因組文庫中篩選。或者利用相應(yīng)的抗體從cDNA表達(dá)文庫中篩選相應(yīng)的克隆。17．答： 基因文庫，或克隆文庫，是一群細(xì)菌克隆，每個克隆含有一個帶有某一供體生物不同DNA片段的質(zhì)?；蚴删w載體；這群克隆有95％99％的可能性使基因組DNA的每一片段至少存在于一個克隆中。一個基因文庫一旦建立，任一特定的克隆都可被回收用于研究其所攜帶的基因，因而在需要克隆某一特定基因時就避免了逐個巡查克隆的耗時過程。為減少所要收集的克隆的數(shù)目，最普遍采用的載體是l噬菌體的一種衍生載體，它可容納12~20kb的供體DNA片段，這點與pBR322不同，它可插入的外源DNA最大約為5kb．18．答： 基因組文庫是用基因工程的方法，人工構(gòu)建的含有某一生物基因組DNA的各種片段 的克隆群。一般以改造的噬菌體DNA或黏粒作為載體，包括下列過程：(1)高分子量染色體DNA的制備；(2)體外重組連接；(3)包裝蛋白的制備；(4)重組體的體外包裝；(5)將重組DNA導(dǎo)人寄主細(xì)胞；(6)篩選。基因組文庫同遺傳學(xué)上所講的基因庫是完全不同的概念?；驇?gene pool)是指在進(jìn)行有性生殖的某一群體中，能進(jìn)行生殖的個體所含總的遺傳信息。在基因組文庫的構(gòu)建中，由于使用的載體不同，分為噬菌體載體和黏粒載體構(gòu)建的基因組文庫、YAC文庫、BAC文庫等。19．答： 同mRNA互補(bǔ)的DNA稱為cDNA。cDNA文庫是以某一生物的總mRNA為模板，在無細(xì)胞系統(tǒng)中，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，首先合成一互補(bǔ)的DNA, 即第一鏈，破壞RNA模板后，再以第一鏈為模板合成第二鏈，得到的雙鏈DNA稱為cDNA。選用適合的載體，將合成的cDNA重組導(dǎo)人寄主細(xì)胞，經(jīng)篩選得到韻cDNA克隆群稱為cDNA文庫。由于cDNA技術(shù)合成的是不含內(nèi)含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一種通用方法。由于細(xì)胞內(nèi)的基因在表達(dá)的時間上并非是統(tǒng)一的，具有發(fā)育的階段性和時間性．有些則需要特殊的環(huán)境條件。所以，cDNA文庫是不可能構(gòu)建得十分全，也就是說任何一個cDNA文庫都不可能包含某—生物全部編碼基因。cDNA文庫與基因組文庫的主要差別是： (1)基因組文庫克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列，cDNA文庫克隆的是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因，包括調(diào)節(jié)基因； (2)基因組文庫克隆的是全部遺傳信息，不受時空影響；cDNA文庫克隆的是不完全的編碼DNA序列，因它受發(fā)育和調(diào)控因子的影響； (3)基因組文庫中的編碼基因是真實基因，含有內(nèi)含子和外顯子；而eDNA克隆的是不含內(nèi)含子的基因。20．答： 黏性末端連接法不足之處有：(1)載體易自身環(huán)化；(2)若是用同一種限制性內(nèi)切核酸酶產(chǎn)生的黏性末端連接又不易定向克隆；(3)難插入特定的基因；(4)再者就是大片段DNA的重組率較低，即使用堿性磷酸酶處理了載體，防止了載體的自身環(huán)化，載體也有成環(huán)的傾向；(5)用這種方法產(chǎn)生的重組體往往含有不止一個外源片段或不止一個載體連接起來的串聯(lián)重組體，增加篩選工作的困難。21．答： 所謂同聚物加尾法就是利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈DNA的3’端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源DNA和載體DNA分子要分別加上不同的寡聚核苷酸，如dA(dG)和dT(dC),然后在DNA連接酶的作用下漣接成為重組的DNA。這種方法的核心是利用末端轉(zhuǎn)移酶的功能，將核苷酸轉(zhuǎn)移到雙鏈DNA分子的突出或隱蔽的339。OH上。以Mg2+作為輔助因子，該酶可以在突出的339。OH端逐個添加單核苷酸，如果用Co2+作輔助因子則可在隱蔽的或平末端的339。OH端逐個添加單個核苷酸。 同聚物加尾法實際上是一種人工黏性末端連接法，具有很多優(yōu)點：．(1)首先不易自身環(huán)化，這是因為同一種DNA的兩端的尾巴是相同的，所以不存在自身環(huán)化。(2)因為載體和外源片段的末端是互補(bǔ)的黏性末端，所以連接效率較高。(3)用任何一種方法制備的DNA都可以用這種方法進(jìn)行連接。同聚物加尾法也有一些不便之處：(1)方法繁瑣；(2)外源片段難以回收。由于添加了許多同聚物的尾巴，可能會影響外源基因的表達(dá)。另外要注意的是，同聚物加尾法同平末端連接法一樣，重組連接后往往會產(chǎn)生某種限制性內(nèi)切核酸酶的切點。22．答： 將人工合成的或來源于現(xiàn)有質(zhì)粒的一小段DNA分子(在這一小段DNA分子上有某種限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列)，加到載體或外源DNA的分子上，這樣便在載體DNA和外源DNA上制造出新的酶切點。把這一小段含有酶切點的DNA分子稱為連接器分子，這種方法稱為接頭連接法。23．答： 同裂酶是一類識別序列不完全相同，但是產(chǎn)生的黏性末端至少有四個堿基相同的限制性內(nèi)切核酸酶。用這些限制性內(nèi)切核酸酶處理載體和外源DNA得到的末端可以通過黏性末端連接法連接。 同裂酶產(chǎn)生的黏性末端雖然可以像完全親和的黏性末端那樣進(jìn)行連接，但是它與完全親和的黏性末端連接不同的是，連接后的產(chǎn)物往往失去原有的限制性內(nèi)切核酸酶的切點，但是能夠被另外一種同裂酶識別。這樣用同裂酶進(jìn)行體外重組時，在限制性內(nèi)切核酸酶切割反應(yīng)之后不必將原有的內(nèi)切酶失活，就可直接進(jìn)行重組連接。由于連接體系中有原有的限制性內(nèi)切核酸酶的存在，就不會發(fā)生載體自連，從而保證了載體同外源DNA的連接。所以在這種連接反應(yīng)中不必用堿性磷酸酶進(jìn)行載體的脫磷反應(yīng)而得到最高的連接效率。反應(yīng)中通常要涉及三種不同的限制性內(nèi)切核酸酶，其中兩種是識別六堿基的酶，另一種是識別四堿基的酶。24．答： 由于基因已被測序并進(jìn)行了分析，因此前體mRNA結(jié)構(gòu)是已知的。這對了解蛋白質(zhì)的功能區(qū)是十分重要的，可以避免有關(guān)多肽翻譯后加工的一些問題。對于間斷基因，cDNA可以用外顯子DNA探針通過體外雜交得以鑒定。將擬南芥的基因組DNA或cDNA分別克隆到酵母人工染色體(YAC)上作為定位或篩選的融合標(biāo)簽，基因可以在酵母中作為細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)或分泌蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)。25．答： (1)加四環(huán)素；(2)Tetr Kans和Tetr Kanr；(3)重新點種在含Tet、Kan和只加Tet的平板上，選擇只在Tet平板上生長的菌落，即為所需的重組體。26．答： 原理： 由于四環(huán)素的作用只是抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，而不是殺死細(xì)菌；而氨基酸類似物環(huán)絲氨酸如果摻人蛋白質(zhì)，則是致命的。因此在有四環(huán)素的條件下，環(huán)絲氨酸能夠殺死tetr而不殺死tets的細(xì)菌。經(jīng)過環(huán)絲氨酸處理后，存活的細(xì)胞中tets型得到很大富集，而經(jīng)過若干次連續(xù)處理，即能獲得在tetr基因內(nèi)含有插人物的質(zhì)粒的細(xì)胞。 基本操作： (1)轉(zhuǎn)化后有三種表型的細(xì)菌，其中只有一種是重組體：AprTcs； (2)用重組DNA轉(zhuǎn)化受體菌后，將受體菌培養(yǎng)在加有四環(huán)素和環(huán)絲氨酸的培養(yǎng)液中培養(yǎng)；此時只有非重組的雙抗性菌可以生長，其他都被抑制； (3)由于有環(huán)絲氨酸的存在，AprTcs表型的菌生長到一定程度就會死亡； (4)由于四環(huán)素只有抑菌而無殺菌作用，此時若解除四環(huán)素(離心洗滌)，加入氨基芐青霉素繼續(xù)培養(yǎng)，則可使重組體大量生長。27．答： 這一方法的基本原理是根據(jù)抗體、抗原分子的三個基本特性而設(shè)計的一種篩選鑒定重組體的方法。這三個基本特性是： (1)抗體分子可以牢固地吸附在固體基質(zhì)(如聚乙烯塑料)上而不被洗脫掉； (2)一個抗原可以同幾種不同的抗體結(jié)合； (3)抗體分子可以通過碘化作用被125I標(biāo)記。28．答： 隨機(jī)引物是人工合成的長度為6個核苷酸的寡聚核苷酸片段群體，含有各種可能的排列順序(46=4096)；或是用DNA酶處理小牛胸腺DNA后獲得的6—12個堿基的片段。將待標(biāo)記的DNA片段同隨機(jī)引物一起進(jìn)行雜交，并以雜交體上的寡聚核苷酸為引物，在Klenow酶的作用下合成互補(bǔ)DNA鏈，當(dāng)反應(yīng)底物中有放射性的dNTP時，新合成的DNA就帶上了標(biāo)記。29．答： 通過一定的物理學(xué)方法將DNA或RNA從凝膠上轉(zhuǎn)移到固體支持物，然后同液體中的探針進(jìn)行雜交。DNA或RNA從凝膠向濾膜轉(zhuǎn)移的過程稱為印跡，故此將這種雜交稱為印跡雜交。30．答： 根據(jù)微孔濾膜雜交和原位雜交的原理而改良的一種篩選重組體的一種核酸雜交方法。它是將生長在或影印在微孔濾膜上的菌落(或噬菌斑)原位溶菌，原位進(jìn)行DNA變性并原位固定在濾膜上，然后用放射性標(biāo)記的探針同固定了的DNA進(jìn)行雜交經(jīng)放射自顯影后，確定哪一個菌落含有重組的DNA分子，再從參比平板上選取重組體。31．答： 1975年Southern建立起來的一種雜交方法，屬固相—液相雜交。該法的主要特點是利用毛細(xì)現(xiàn)象將DNA轉(zhuǎn)移到固體支持物上，稱為Southern轉(zhuǎn)移或Southern印跡 (Southern blotting)。它首先用合適的限制性內(nèi)切核酸酶將DNA切割，進(jìn)行電泳分離后，利用干燥的吸水紙產(chǎn)生毛細(xì)作用，使液體經(jīng)過凝膠，從而使DNA片段由液流攜帶從凝膠轉(zhuǎn)移并結(jié)合在固體支持物表面。32．答： Northern印跡的原理同Southern印跡相比有兩點不同： (1)轉(zhuǎn)移的對象不同，Northern印跡是將RNA變性及電泳分離后，將其轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過程。 (2)雖然RNA電泳前不需像DNA那樣進(jìn)行酶切，但也需要變性。不過變性方法是不同的，它不能用堿變性，因為堿變性會導(dǎo)致RNA的降解。33．答：帶有某一細(xì)菌基因的克隆通?？梢灾苯涌闯鰜?，因為基因表達(dá)引起了宿主細(xì)胞表型的可見變化。然而，真核生物的基因不都表達(dá)，則需用相應(yīng)的方法來找出帶有所需基因特定克隆。一個常用方法是雜交(圖A21．1)： (1)從不同的克隆提取DNA，固定于硝酸纖維素濾膜上，然后用NaOH使之變性(圖 A21．)。 (2)探針必須能與所需的基因互補(bǔ)且被32p標(biāo)記。探針可以是來自另一不同生物體的相關(guān)的基因，或是依據(jù)與基因特異相關(guān)蛋白質(zhì)的氨基酸序列設(shè)計并經(jīng)化學(xué)合成的一小段DNA分子(圖A21．1．2)。 (3)探針只會與特定基因進(jìn)行堿基配對(雜交)，沖洗濾膜后，未結(jié)合上的標(biāo)記探針會被除去(圖A21．)。 (4)烘干濾膜后進(jìn)行放射自顯影后，所需的克隆就以一個黑點在膠片上顯示出來，這就是菌落或原位雜交分析。五、綜合題1．如何以大腸桿菌質(zhì)粒DNA為載體克隆一個編碼動物激素的基因，并使之在大腸桿 菌中進(jìn)行表達(dá)?簡要說明實驗中可能遇到的問題及可能的解決辦法。2．你打算將一個具有KpnI末端的DNA片段克隆到具有BamHI末端的載體中。問題是BamHI和KpnI的末端是不匹配的，BamHI是5’突出端，KpnI則是突出的3’ 端(圖22．7)。一位朋友建議用圖22．7所示的寡聚核苷酸“片段”來進(jìn)行連接。你并沒有馬上意識到這種方法可行，因為你想到的連接作用需要鄰近的5’磷酸和3’羥基。雖然寡聚核苷酸分子被限制性內(nèi)切核酸酶切割后會產(chǎn)生合適的末端，但是，合成的寡聚核苷酸的末端都是羥基。另外，雖然圖22．7中接頭是BamHIKpnI，但另一個接頭卻是KpnIBamHI，你懷疑相同的寡聚核苷酸是否能夠適合這兩種方式的連接。 BamH I切割載體DNA 5’GATCG——————————————————————G3‘ 3’C——————————————————————CCTAG5‘ Kpn I 切割的片斷 5’C——————GGTAC3’ 3’